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May 30, 2023

OrganoidChip ermöglicht Hydrogel

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11268 (2023) Diesen Artikel zitieren 2350 Zugriffe auf 12 Details zu altmetrischen Metriken Organoide sind dreidimensionale Strukturen selbstorganisierter Zellaggregate

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11268 (2023) Diesen Artikel zitieren

2350 Zugriffe

12 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Organoide sind dreidimensionale Strukturen selbstorganisierter Zellaggregate, die anatomische Merkmale von In-vivo-Organen nachahmen und als miniaturisierte In-vitro-Organmodelle für Arzneimitteltests dienen können. Die effizienteste Methode zur Untersuchung der Toxizität und Wirksamkeit von Arzneimitteln erfordert die hochauflösende Bildgebung einer großen Anzahl von Organoiden, die in kürzester Zeit erfasst werden. Derzeit fehlen geeignete Plattformen, die eine schnelle High-Content-Bildgebung von Organoiden ermöglichen. Um diese Wissenslücke zu schließen, präsentieren wir den OrganoidChip, eine mikrofluidische Bildgebungsplattform, die ein einzigartiges Design zur Immobilisierung von Organoiden für eine schnelle Endpunkt-Bildgebung beinhaltet. Der Chip enthält sechs parallele Einfangbereiche, von denen jeder über eine Bereitstellungs- und Immobilisierungskammer verfügt, die von ihren nativen Kulturplatten übertragene Organoide aufnimmt bzw. verankert. Wir zeigen zunächst, dass der OrganoidChip Darm- und Herzorganoide effizient immobilisieren kann, ohne ihre Lebensfähigkeit und Funktionalität zu beeinträchtigen. Als nächstes zeigen wir die Fähigkeit unseres Geräts, die dosisabhängigen Reaktionen der Lebensfähigkeit und spontanen Kontraktionseigenschaften von Organoiden auf die Behandlung mit Doxorubicin zu bewerten und Ergebnisse zu erzielen, die denen von Off-Chip-Experimenten ähneln. Wichtig ist, dass der Chip die Bildgebung von Organoiden mit Geschwindigkeiten ermöglicht, die um eine Größenordnung höher sind als bei herkömmlichen Bildgebungsplattformen, und die Aufnahme verschwommener Bilder verhindert, die durch das Driften, Schwimmen und schnelle Bühnenbewegungen der Organoide verursacht werden. Zusammengenommen ist der OrganoidChip eine vielversprechende mikrofluidische Plattform, die als Baustein für ein Multiwell-Plattenformat dienen kann, das in Zukunft eine Hochdurchsatz- und hochauflösende Bildgebung von Organoiden ermöglichen kann.

In den letzten Jahren hat sich die Organoid-Technologie zu einem fortschrittlichen In-vitro-Modell entwickelt, das die inhärenten Eigenschaften des entsprechenden Organgewebes nachbilden kann1. Um verschiedene Zelltypen zu untersuchen und die in der organoiden Mikroumgebung auftretenden Phänomene zu verstehen, ist High-Content-Imaging (HCI) erforderlich. Um dieses Ziel zu erreichen, sind Plattformen erforderlich, die eine automatisierte, effiziente und schnelle hochauflösende Bildgebung der Proben mit hohem Durchsatz ermöglichen. Für HCI sind Geräte mit flachem Boden unerlässlich, die Organoide an vorgegebenen Orten immobilisieren.

Bestehende Technologien erfüllen nur teilweise alle HCI-Anforderungen. Beispielsweise sind Multiwell-Platten ein herkömmliches Mittel für die Hochdurchsatzkultivierung und das Screening von Organoiden (d. h. 96-, 384- und 1536-Well-Formate). Diese Platten verfügen über Vertiefungen mit rundem U-, V- oder M-förmigem Boden (z. B. Elplasia® und Aggrewell™), die die Bildung von Organoiden (oder Sphäroiden) durch Selbstorganisation erleichtern2,3,4. Allerdings führt die Abweichung vom Flachboden in diesen Vertiefungen zu Aberrationen und ermöglicht keine hochauflösende Abbildung der Organoide5. Um dieses Problem zu bekämpfen, müssen Benutzer Organoide für eine hochauflösende und konfokale Bildgebung auf eine Multiwell-Platte mit einer Glasoberfläche mit flachem Boden übertragen2. Selbst wenn der Transfer von Organoiden erfolgreich gelingt, sind die Multiwellplatten mit flachem Boden anfällig für Organoiddrift bei schnellen Bühnenbewegungen oder natürlicher Konvektion innerhalb der Wells während der Bildgebung. Diese Probenbewegungen behindern erheblich die volumetrische und hochauflösende Bildgebung großer Organoide, die die Erfassung mehrerer Sichtfelder (FOVs) und Z-Stapel erfordern, um ein ganzes Organoid abzubilden. Neben dem Driften ist auch die Lokalisierung jedes Organoids innerhalb eines gesamten Bohrlochs zeit- und arbeitsintensiv. Dieser Prozess erfordert den Wechsel zwischen Objektiven mit niedriger und hoher Vergrößerung und eine wiederholte Neufokussierung, um die Position des Organoids zu bestimmen. Ein weiterer Nachteil von Multiwellplatten mit flachem Boden besteht in der Gefahr, dass sich einige Organoide an den Rändern der Wells befinden, was zu kontrastarmen und verzerrten Bildern führt.

Neue mikrofluidische Designs6,7, darunter das Pu.MA-System8 und einige andere Plattformen, wie die Akura-Platten5 (InSphero AG), haben die oben genannten Probleme teilweise überwunden, indem Organoide in Vertiefungen mit kleinerem Durchmesser (~ 0,4–4 mm4,5) platziert wurden ,6,7,8). Diese Funktion hält die Organoide innerhalb eines begrenzten Sichtfelds und macht ihre Lokalisierung überflüssig. Allerdings ermöglichen solch kleine Vertiefungen nur eine Bildgebung mit niedriger Auflösung, da die Organoide nicht stationär im Sichtfeld sind. Daher können sich Organoide immer noch aufgrund von Platten- oder schnellen Tischbewegungen, neigungsbasierter Perfusion innerhalb des Mikrofluidikchips6 und jeglichen intrinsischen Probenbewegungen bewegen, wie dies bei spontan kontrahierenden Herzorganoiden der Fall ist.

Die gebräuchlichste Immobilisierungsmethode umfasst das Einbetten oder Formen von Organoiden in Hydrogelen, die deren Bildgebung ermöglichen, wenn auch mit reduzierter Auflösung1,9. Solche Immobilisierungsmethoden auf Hydrogelbasis bieten keine Kontrolle über die Position der Organoide innerhalb von Hydrogelen. Am häufigsten sind Organoide zufällig im Hydrogel in unterschiedlichen Abständen vom Mikroskopobjektiv und den Sichtfeldern verteilt. Diese zufällige Verteilung führt zu längeren Bildgebungszeiten zur Lokalisierung der Organoide im Hydrogel und erfordert Objektive mit großem Arbeitsabstand, die üblicherweise über begrenzte Bildauflösungen verfügen.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, präsentieren wir einen neuen mikrofluidischen Bildgebungschip namens OrganoidChip mit einem neuartigen Design, das für die hochauflösende Bildgebung keine Verwendung von Hydrogelen erfordert. Der Chip empfängt Organoide von ihren herkömmlichen Kulturplatten, in denen sie zu Organoiden entwickelt und mit Arzneimitteln behandelt wurden, und hält sie stabil in seinen Immobilisierungskammern, um die Endpunkt-Kalziumtransienten- und Lebend/Tot-Bildgebung zu ermöglichen (Abb. 1). Wir haben den Chip mit sechs parallelen Einfangbereichen (TAs) entworfen, die jeweils aus zwei aufeinanderfolgenden Kammern bestehen: der Staging-Kammer (SC) und der Immobilisierungskammer (IC). Die Kammern wurden so konzipiert, dass sie die Organoide seitlich und/oder vertikal leicht komprimieren, um die nötige Reibung bereitzustellen, um die Organoide während der Bildgebung vollständig zu immobilisieren und Unschärfen aufgrund von Organoidbewegungen auf dem Chip zu vermeiden. Die vorgegebenen Positionen der Immobilisierungskammern beschleunigen den Bildgebungsprozess, indem sie das Scannen über ein großes Sichtfeld zur Lokalisierung der Organoide und den Wechsel zwischen Objektiven mit niedriger und hoher Vergrößerung während der hochauflösenden Bildgebung überflüssig machen. Als Proof-of-Concept demonstrieren wir die einzigartigen Fähigkeiten des OrganoidChip, indem wir Herz- und Darmorganoide erfolgreich immobilisieren, die mit einem Chemotherapeutikum, Doxorubicin (DOX), in steigenden Konzentrationen behandelt wurden. Diese Plattform ermöglicht eine bildbasierte Analyse der DOX-Behandlung und zeigt Werte der 50 %igen Hemmkonzentration (IC50), die mit Ergebnissen außerhalb des Chips vergleichbar sind.

Ein Flussdiagramm, das die Hauptschritte der OrganoidChip-Experimente beschreibt (a) und verschiedene Ursachen für Bildunschärfe und Datenverlust, die durch mangelnde ordnungsgemäße Immobilisierung verursacht werden (b). (a) Die Organoide wurden auf Multiwellplatten kultiviert und dann 48 Stunden lang DOX ausgesetzt. Anschließend wurden Organoide zur Immobilisierung in den OrganoidChip eingeführt, gefolgt von Kalziumtransienten (Herzorganoiden) und Lebend-/Tot-Bildgebung. (b) Die Abbildung besteht aus drei Reihen, von denen jede einen Mechanismus darstellt, der die hochauflösende Bildgebung stört. Die obere Reihe zeigt die Drift, die durch natürliche Konvektion im Schacht eines Kammerschiebers über einen Zeitraum von 5 s verursacht wird. Die mittlere Reihe verdeutlicht, wie schnelle Bühnenbewegungen bei kurzen Belichtungszeiten zu Unschärfen führen können. Typischerweise führen größere Impulse und kürzere Belichtungszeiten (in der Abbildung als „ex“ dargestellt) zu größerer Unschärfe. Die untere Reihe zeigt, wie weit sich ein Herzorganoid während der Bildgebung von Kalziumtransienten in 15 s in einer Petrischale fortbewegen oder „schwimmen“ kann. Maßstabsbalken repräsentieren 200 µm.

Wir haben den Mikrofluidik-Chip hergestellt, indem wir eine dreischichtige Form hergestellt haben, die durch Photolithographie der negativen Photoresists SU8-2050 und SU8-2100 und anschließende Softlithographie von Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt wurde. Während der Herstellung wurden drei Fotolackschichten mit Höhen von 100, 190 und 260 µm gestapelt, um in unserem Gerät Kanalhöhen von 100, 290 bzw. 550 µm bereitzustellen. Kurz gesagt wurde ein 4-Zoll-Siliziumwafer (STK9671-1, Nova Electronic Materials) 30 Minuten lang auf einer Heizplatte bei 120 °C dehydriert und auf einem Spin-Coater installiert. Je nach gewünschter Schichtdicke haben wir 4 ml entweder SU8-2050 oder SU8-2100 in die Mitte gegossen und geschleudert. Der Wafer wurde vorsichtig aus dem Spin-Coater entnommen und weichgebacken. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Wafer durch die gedruckte hochauflösende Mylar-Maske der spezifischen Schicht UV-Strahlung ausgesetzt. Der Wafer-Fotolack wurde erst nach der ersten und dritten UV-Belichtung entwickelt (siehe Ergänzungstabelle S1 für die bei der Herstellung verwendeten Zeitmengen, Temperaturen usw.). Die Form wurde mit (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL) TRICHLOROSIL-ANE (Gelest, Inc.) 72 Stunden lang versalzen, um die ordnungsgemäße Trennung der Form vom PDMS zu erleichtern.

Für die Soft-Lithographie wurden das Basispolymer und der Härter im Verhältnis 10:1 (Gew./Gew.) gemischt. Die Mischung wurde in einer Vakuumkammer entgast und dann langsam auf die Form gegossen, gefolgt von einem 6-stündigen Ofenbacken bei 75 °C. Das PDMS wurde abgezogen, für Einlass- und Auslassschläuche ausgestanzt und mithilfe einer Sauerstoffplasmabehandlung mit einem Deckglas Nr. 1,5 verbunden, um den Chip zu bilden.

Die Abb. 2a zeigt den mikrofluidischen Aufbau. Der Fluss im Chip wurde durch einen Luftdruckregler (ITV0010-3UBL, SMC) reguliert, der Drücke zwischen 0,01 und 1 bar liefern kann. Der Ausgang des Reglers wurde mit zwei mit Kulturmedium gefüllten Behältern verbunden, um einen druckgesteuerten Fluss herzustellen. Die Reservoirs und der Chip wurden mit zwei Magnetventilen verbunden, um eine fluidische H-Brücke zu bilden. Mit diesem Design konnten wir die Flussrichtung innerhalb des Chips jederzeit umkehren, indem wir die Magnetventile mit einer DAQ-Karte (NI USB-6009) und einem LabVIEW-Programm (Version 13.0f2) steuern.

Mikrofluidisches Gerätedesign von OrganoidChip und sein Aufbau zur Immobilisierung mehrerer Organoide für eine verwacklungsfreie Bildgebung. (a) Der mikrofluidische Aufbau, der die Vorwärts- und Rückwärtsflusssteuerung (blau bzw. orange) innerhalb des Chips ermöglicht, wurde durch die Schaffung einer fluidischen H-Brücke mit zwei Magnetventilen erleichtert. (b) Eine schematische Seitenansicht des Chips, die seine Funktionsweise demonstriert. Organoide werden in den Glaszylinder, der oben auf dem Chip-Einlass installiert ist, pipettiert, in den Hauptbereich geladen und im Einfangbereich (TA) innerhalb der Staging-Kammer (SC) oder Immobilisierungskammer (IC) immobilisiert, was eine verwacklungsfreie Bildgebung ermöglicht. (c) Ein Bild des gesamten Chips; seine Höhe ändert sich und seine verschiedenen Abschnitte mit gestrichelten Kästchen in verschiedenen Farben, der Hauptbereich (orange), SC (grün), IC (blau), TA (rot), Austrittskammer (orange) und der schlangenförmige Austrittskanal mit einer Breite von 315 µm und einer Länge von 71 mm. Auf der rechten Seite der Abbildung zeigt ein Profil die Höhenunterschiede vom Hauptbereich bis zum Austrittskanal. Mehrere Bilder wurden zusammengefügt, um das Bild eines gesamten Chips zu ergeben. Der Maßstabsbalken entspricht 1 mm.

Vor dem Laden der Organoide durchlief der Chip mehrere Perfusionsschritte. Das Gerät wurde zunächst mit entionisiertem Wasser durchströmt, um Luftblasen zu entfernen, gefolgt von einer Sterilisation mit Ethylalkohol und zuletzt mit Kulturmedium. Ein Glaszylinder (Precigenome LLC) wurde über einen Luer-Lock mit dem Schlauch verbunden, der das Kulturmedium liefert, und am Chip-Einlass montiert, der als Nährstoffreservoir diente. Der Glaszylinder diente auch als Zugangspunkt zum Laden der Organoide und der Fluoreszenzfarbstoffe auf den Chip (Abb. 2a,b). Um einen hydrostatisch angetriebenen Fluss innerhalb des OrganoidChips zu etablieren, der bei Verwendung eines oben offenen Glasfasses erforderlich war, platzierten wir das Abfallreservoir 10 cm unter dem Chipniveau. Dieser Höhenunterschied sorgte für eine Flussrate von 16 µl/min im Chip. Der hydrostatisch angetriebene Fluss wurde durch Öffnen des Magnetventils eingeleitet, das den Spanauslass mit dem Abfallbehälter verband.

CMV-GCaMP2-transfizierte humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs), ein Geschenk von Dr. Bruce Konklin, wurden zur Erzeugung von Herzorganoiden und zur Visualisierung spontaner intrazellulärer Kalziumtransienten verwendet. hiPSCs wurden in Complete Essential 8 Media (E8, StemCell Technologies) auf mit Vitronectin beschichteten Kulturschalen gehalten. Vor der Herzdifferenzierung wurden hiPSCs mit einer Aussaatdichte von 3,16 × 105 Zellen/cm2 auf Matrigel-beschichtete Multiwell-Platten ausgesät. Bei Erreichen einer Konfluenz von 80 % wurde die Herzdifferenzierung durch Modulation des WNT/β-Catenin-Signalwegs initiiert22.

Spontan schlagende Kardiomyozyten wurden 21 Tage nach Beginn der Differenzierung mit Accutase (StemCell Technologies) geerntet. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Zelldichten in 96-Well-Platten mit rundem Boden und extrem geringer Anhaftung (Nexcelom Biosciences) ausgesät. Anschließend wurden die geimpften Platten 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, um die Zellaggregation zu erleichtern. Die Organoide wurden 48 Stunden lang in Suspension in RPMI-1640-Medium (Hyclone™), ergänzt mit B-27 mit Insulin (Gibco™) und 10 µM ROCK-Inhibitor, kultiviert, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Organoidbildung zu fördern. Danach wurden die Medien durch Medien ohne ROCK-Inhibitor ersetzt und die Organoide wurden in einzelnen Vertiefungen gehalten, bis sie zur DOX-Behandlung auf Kammerobjektträger übertragen und anschließend mit Chips beladen wurden.

Die Entnahme und Analyse von Darmbiopsieproben von Hunden wurde zuvor vom Institutional Animal Care and Use Committee der Iowa State University (ISU) genehmigt (IACUC-19–102; PI: Albert E. Jergens). Alle Methoden wurden gemäß den relevanten Richtlinien und Vorschriften der IACUC gemäß den US-Bundesvorschriften durchgeführt (Fish, 2004). Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org)23 berichtet.

Wir verwendeten Darmkrypten von Hunden, die LGR5+-Stammzellen enthielten, um die schnelle Bildung reifer Darmorganoide zu ermöglichen9. Darmkrypten von Hunden wurden aus endoskopischen Biopsien gesunder erwachsener Hunde an der Iowa State University (IACUC-22–050) gewonnen. Reife Organoide, die Zotten, Krypten und Lumen enthalten, könnten typischerweise innerhalb von 3 bis 6 Tagen nach einer Passage produziert werden4,24. Zum Zeitpunkt der Aussaat wurden Darmkrypten von Hunden in Matrigel (Corning® Matrigel® GFR) suspendiert und in 20-µl-Tröpfchen auf eine 24-Well-Platte verteilt. Typischerweise enthielt jedes Matrigel-Pad 20 – 25 Organoide. Wenn Organoide größer als 400 µm wurden, verwendeten wir ein Aufteilungsverhältnis von 1:3. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurden 0,5 ml des Komplettmediums mit Wachstumsfaktoren (CMGF+), das 10 µM ROCK-Inhibitor und 2,5 µM GSK3β-Inhibitor enthielt, in jede Vertiefung gegeben und 48 Stunden lang aufbewahrt. Als nächstes wurde das Medium durch frisches CMGF+ ohne ROCK- und GSK3β-Inhibitoren ersetzt und 7 Tage lang alle 48 Stunden kontinuierlich aufgefrischt. Die Organoide in den Matrigel-Pads wurden am 7. Tag passagiert und expandiert.

Um die Organoide passieren zu können, wurden sie zunächst aus den Matrigel-Pads geborgen. Kurz gesagt, die Matrigel-Pads wurden dissoziiert, indem zunächst das verbrauchte Medium entfernt und 0,5 ml Komplettmedium ohne Wachstumsfaktoren (CMGF−) bei 4 °C in jede Vertiefung gegeben wurde, um das gesamte Matrigel-Pad zu pipettieren, bis es zerbrochen und von der Wellplatte getrennt wurde . Anschließend wurde die Suspension 5 Minuten lang bei 4 °C und 100 g zentrifugiert und der Überstand entfernt.

Zur Passage wurde 1 ml TrypLE Express (Gibco, ThermoFisher Scientific) zum Pellet gegeben und 10 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 100 g und 4 °C wurde der Überstand entfernt und durch 5 ml CMGF- ersetzt, um die Dissoziation zu stoppen. In einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt wurde CMGF− durch die erforderliche Menge 4 °C Matrigel ersetzt (abhängig von der Anzahl der Zellen). Die Suspension wurde in Form von 15 bis 20 µl großen Tröpfchen auf eine Platte mit 24 Vertiefungen verteilt. Die Platte wurde 10 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um die Verfestigung des Matrigels zu ermöglichen; Anschließend wurden zur weiteren Kultivierung 500 µl CMGF+ in jede Vertiefung gegeben. Die Matrigel-Pads wurden 3 oder 4 Tage nach jeder Passage gereinigt, um tote und degenerative Zelltrümmer sowie sehr kleine Organoide zu entfernen9. Der Reinigungsprozess umfasste alle oben beschriebenen Schritte zur Organoidgewinnung aus Matrigel-Pads mit Ausnahme der TrypLE Express-Behandlung.

Vor der DOX-Behandlung wurden Darmorganoide dreimal passagiert und anschließend 7 Tage lang kultiviert, wobei am 5. Tag eine Reinigung durchgeführt wurde, um die geeignete Organoidgröße und -morphologie zu erhalten. Für die Chipbeladung wurden zunächst Darmorganoide aus den Matrigel-Pads gewonnen, wie oben beschrieben. Ein zusätzlicher Schritt war erforderlich, um jegliches verbleibende Matrigel auf den Organoiden vollständig zu dissoziieren. Dieser Schritt war unerlässlich, um jegliche Organoid-Agglomeration zu verhindern. Konkret fügten wir 1 ml der Cell Recovery Solution (Corning Inc.) zum zentrifugierten Pellet hinzu, pipettierten einige Male und inkubierten dann die gewonnenen Organoide 30 Minuten lang bei 4 °C, um jegliches Matrigel, das noch daran haftete, vollständig zu dissoziieren Organoide. Nach einer zusätzlichen Zentrifugation bei 100 g für 5 Minuten bei 4 °C wurde das Pellet mit den sauberen Organoiden in CMGF gewonnen und zum Laden in den Chip in eine Petrischale überführt.

Wir verwendeten Organoide mit einem Durchmesser von 300 bis 500 µm für die Behandlung mit DOX (0,1 % (v/v) in DMSO; ergänzende Abbildung S1) für 48 Stunden. Herzorganoide wurden zunächst von 96-Well-Rundbodenplatten auf Kammerobjektträger (Ibidi Inc.) mit einem 170 µm dicken Glasdeckglas übertragen, um eine aberrationsfreie Bildgebung zu ermöglichen. Vor der DOX-Behandlung wurden Herzorganoide über Nacht in Kammerobjektträgern mit 8 Vertiefungen inkubiert und auf Hellfeld- und Kalziumtransienten abgebildet. Diese Messungen dienten als Grundlage für die Analyse der Kardiotoxizität von DOX. Herzorganoide wurden mit 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 5 und 10 µM DOX behandelt. Darmorganoide wurden 0, 0,1, 0,3, 1 und 2 µM DOX in Matrigel-Pads auf ihrer nativen 24-Well-Platte ausgesetzt. Die maximale Konzentration, der die Darmorganoide ausgesetzt waren, war aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit gegenüber DOX25,26 etwas niedriger.

Wir führten eine 10-s-lange Kalzium-Zeitrafferbildgebung von Herzorganoiden vor und 48 Stunden nach der DOX-Behandlung durch, um die Veränderung der Schlagkinetik von Organoiden in Kammerobjektträgern zu überwachen (Daten zur Schlagkinetik außerhalb des Chips). Anschließend wurden dieselben Organoide auf den Chip übertragen und vor der Bildgebung auf dem Chip 100 Minuten lang in den TAs eingewöhnt. Während der Bildgebungssitzungen wurden Herzorganoide in den Kammerobjektträgern und die Chips in einem befeuchteten Mini-Inkubator (TA-MI-20 × 46, Bioscience Tools) bei 37 °C gehalten. Die ergänzende Abbildung S1 zeigt ein detailliertes Flussdiagramm, das die gesamte DOX-Behandlung und die Kalziumbildgebung der Herzorganoide auf Kammerobjektträgern und dem OrganoidChip beschreibt.

Um Veränderungen in der Schlagkinetik von Herzorganoiden zu analysieren, wurden Regionen innerhalb des Organoids identifiziert, die Kalziumtransienten zeigten, und ihre durchschnittlichen Signale wurden über Zeitrafferbilder hinweg überwacht. Die aus diesen Regionen extrahierten Schlagwellenformen wurden verwendet, um verschiedene Parameter der Schlagkinetik mithilfe eines hauseigenen MATLAB-Codes abzuschätzen. Insbesondere haben wir die Schlagrate (BR) und das Verhältnis der Änderung der Calciumfluoreszenzintensität zur Grundlinienintensität (ΔF/F0) gemessen. Wir haben auch den Prozentsatz der Schlagzeit (BT75) und die Schlagleistung (FBT75) geschätzt, definiert durch:

wobei \({T}_{BR}\) die durchschnittliche Schlagperiode eines Organoids darstellt und \({T}_{75}\) die durchschnittliche Schlagdauer darstellt, bis die GCaMP-Fluoreszenzamplitude um 75 % abfällt (Ergänzende Abbildung). S2). Anschließend berechneten wir die fraktionalen Änderungen (\(\Delta \left(X\right)\)) verschiedener Parameter für jedes einzelne Organoid gemäß:

wobei \({X}_{pre\_tx}\) die Vorbehandlung darstellt und \({X}_{post\_tx}\) die Nachbehandlungswerte des spezifischen Parameters darstellt. Um die Vor- und Nachbehandlungswerte zu messen, mussten wir einzelne Organoide verfolgen, während sie vom Kammerobjektträger auf den Chip übertragen wurden, indem wir ihre Form, Fläche und Helligkeit betrachteten.

Wir haben die eingeschlossenen Organoide auf dem Chip mit Calcein AM (Invitrogen™), Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) (Invitrogen™, Waltham, MA) und Hoechst 33.342 (ThermoFisher Scientific Inc.) gefärbt, um lebende und tote Zellen zu markieren bzw. die Zellkerne. Alle Farbstoffe wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers in Kulturmedien in einer Konzentration von 2 µM verabreicht. Die Farbstoffe wurden durch den Glaszylinder in den Chip eingeführt, indem die Kulturmedien durch Farbstofflösungen ersetzt und ein hydrostatisch angetriebener Fluss in einem Ein-Aus-Zyklus (1 Minute ein und 10 Minuten aus) für insgesamt 50 Minuten angewendet wurden. Wir verwendeten eine Flussrate von 16 µl/min, was ausreichte, um das gesamte Chipvolumen von ~ 7,7 µl in weniger als 1 Minute zu ersetzen. Vor der Bildgebung haben wir den Chip 2 Minuten lang mit frischem Kulturmedium perfundiert, um ungebundenen Farbstoff zu entfernen und das Hintergrundsignal der Bildgebung zu minimieren. Wir haben die Organoide mithilfe von Weitfeld- und konfokalen Fluoreszenzmikroskopien abgebildet.

Um die Auswirkungen des OrganoidChips zu kontrollieren, wurde eine Untergruppe von Herz- und Darmorganoiden außerhalb des Chips gefärbt und abgebildet (als „Off-Chip“ bezeichnet). Off-Chip-Organoide wurden auf ähnliche Weise mit 2 µM Farbstoffen behandelt, gefolgt von einer 50-minütigen Inkubation bei 37 °C. Die Off-Chip-Herz- und Darmorganoide wurden auf 8-Well-Kammerobjektträgern mit flachem Boden bzw. innerhalb der Matrigel-Pads in 24-Well-Platten abgebildet.

Für die Lebensfähigkeitsanalyse haben wir zunächst mithilfe des Hellfeldbilds eine Maske erstellt, um die Grenzen der Organoide zu definieren. Wir verwendeten die Maske auf den Projektionsbildern mit maximaler Intensität, um die mittlere Intensität der lebenden (Sgreen) und toten (Sred) Signale der Pixel innerhalb der Maske zu berechnen und definierten das Lebensfähigkeitsverhältnis (VR) jedes Organoids gemäß:

Für die DOX-Behandlungsexperimente normalisierten wir die VR jedes Organoids mit der durchschnittlichen VR der Vehikelkontrollorganoide, um den Prozentsatz der Lebensfähigkeit in Bezug auf die Kontrolle zu erhalten.

Für die Weitfeld- und Fluoreszenzbildgebung wurde eine digitale CMOS-Kamera ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU (Hamamatsu Photonics KK) zusammen mit einem invertierten Mikroskop IX73 (Olympus) verwendet. Für die automatisierte Bildgebung und Positionierung der Wellplatten und des Chips während der Bildgebung auf dem inversen Mikroskop wurde ein automatischer XYZ-Tisch der Serie PZU-2000 mit einer mehrachsigen Tischsteuerung ASI MS-2000-WK verwendet. Zeitrafferbilder wurden mit 100 Bildern pro Sekunde aufgenommen, um die Kalziumtransienten zu erfassen (10 × , 0,3 NA-Objektiv, Olympus). Der gesamte Bildgebungsaufbau wurde mit einem selbst entwickelten LabVIEW-Programm (NI, USA) gesteuert.

Unmittelbar nach der Lebend-/Tot-Bildgebung auf dem Weitfeldmikroskop wurde eine konfokale Abbildung gefangener Organoide auf dem Chip durchgeführt (Leica TAS SP8). Die Z-Bilder von Calcein AM (Anregung: 488 nm, Bandpassfilter: 493–547 nm), EthD-1 (Anregung: 552 nm, Bandpassfilter: 557–784 nm) und Hoechst (Anregung: 405 nm, Bandpassfilter). : 410–483 nm) wurden mit Schrittweiten von 5 und 3 µm unter Verwendung der 10-fach- bzw. 40-fach-Objektive erfasst. Die gesamte Bildverarbeitung wurde mit ImageJ (NIH) durchgeführt.

Wir verwendeten OriginPro (OriginLab Corporation, Version 9.9.0.225), um statistische Analysen, Kurvenanpassungen für die Dosis-Wirkungs-Bewertungen und IC50-Berechnungen durchzuführen. Wir haben die p-Werte für Gruppenvergleiche mithilfe von t-Tests oder F-Tests berechnet, wobei p < 0,05 (*) und p < 0,005 (**) als signifikant angesehen wurden, nachdem wir die Normalitätsannahmen überprüft und die Varianzgleichheit überprüft hatten. Das sigmoidale Imax-Modell und die Regressionsparameter sind in der Ergänzungsgleichung angegeben. S1 und Tabelle S2. Die Datenpunkte in den Kurven und Tabellen werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt.

Herkömmliche Methoden zur Abbildung von Organoiden erweisen sich aufgrund der zufälligen Anordnung der Organoide in den Vertiefungen einer Multiwell-Platte und ihrer Neigung zu Bewegungen während der Abbildung als schwierig. Erstens können natürliche Konvektion oder schnelle Bühnenbewegungen einen Medienfluss verursachen, der möglicherweise dazu führt, dass ein Organoid innerhalb oder sogar aus dem Sichtfeld driftet. Das Driften von Organoiden kann zur Aufnahme unscharfer Bilder führen, während sich außerdem die Fokusebene des Organoids während seiner Bewegung im Kulturmedium ständig ändert (Abb. 1b, Zusatzvideo S1). Wir demonstrierten die durch schnelle Bühnenbewegungen verursachte Unschärfe, indem wir zunächst Darmorganoide aus ihrem nativen Matrigel entnahmen, sie in einen Kammerobjektträger einführten und unmittelbar nach jeder Bühnenbewegung Bilder mit verschiedenen Belichtungszeiten (10 bis 100 ms) aufnahmen. Die resultierenden Bilder zeigten, dass größere Organoide mit höheren Impulsen nach dem Anhalten der Bühne größeren Bewegungen ausgesetzt waren und nicht zu vernachlässigende Unschärfen in den Bildern erzeugten (Abb. 1b; weitere Einzelheiten siehe ergänzende Abbildung S3). Um dieses Problem zu beseitigen, muss man die Bühnengeschwindigkeit verringern oder eine Wartezeit hinzufügen, bis sich die Organoide gesetzt haben, bevor das nächste Bild aufgenommen wird, was die Gesamtbildgebungszeit erhöht, insbesondere bei Assays mit hohem Durchsatz.

Andererseits können sich Organoide, die sich spontan zusammenziehen, innerhalb des Sichtfelds bewegen/schwimmen, was bei Zeitrafferaufnahmen zu unscharfen Bildern führt. Diese Herausforderung wird besonders deutlich, wenn wir die Kalziumtransienten in unseren spontan kontrahierenden Herzorganoiden abbilden, in denen der interessierende fluoreszierende Bereich einer erheblichen Bewegung unterliegt. Abbildung 1b und das Zusatzvideo S2 zeigen ein Herzorganoid, das sich in Kulturmedien in einem Kammerobjektträger fortbewegt, was durch die Bewegungsausbrüche nach seinen Kontraktionen belegt wird. Die Überwachung des sich bewegenden Interessenbereichs erfordert eine erhebliche Nachbearbeitung. Noch wichtiger ist, dass das Fehlen einer vollständigen Immobilisierung dazu führen kann, dass eine Probe abdriftet oder ganz aus dem Sichtfeld herausgeschleudert wird, was zu einem vollständigen Datenverlust führt. Im Gegensatz dazu präsentieren wir die Zusatzvideos S3 und S4, die die Hellfeld- bzw. Fluoreszenzvideos eines stark kontrahierenden Organoids zeigen, das in einem Einfangbereich (TA) immobilisiert bleibt, was den Vorteil des OrganoidChips gegenüber herkömmlichen Bildgebungsplattformen demonstriert.

Der OrganoidChip wurde entwickelt, um den Herausforderungen im Zusammenhang mit Organoidbewegungen durch eine einzigartige Geometrie zu begegnen und die Immobilisierung von Organoiden an vorher festgelegten Orten zu erleichtern. Während die Immobilisierung von Organoiden jegliche Bewegung verhindert, erübrigen die bekannten Standorte immobilisierter Organoide die mühsame Suche nach Organoiden während der Bildgebung.

Der Chip besteht aus vier Abschnitten: (i) Hauptbereich, (ii) TAs, (iii) Austrittskammer und (iv) Austrittskanal (Abb. 2c). Der Hauptbereich fungiert als Diffusor, indem er den Fluss vom Chip-Einlass zu den Kammern erweitert und so die Verteilung der Organoide unter den TAs beim Eintritt in den Chip erleichtert. Hier haben wir ein Chipdesign mit 6 parallelen TAs demonstriert. Dieses Design stellt sicher, dass jeder TA nur ein einziges Organoid einfängt. Wenn ein TA ein Organoid erhält, erhöht sich sein hydraulischer Widerstand; Daher lenkt die Strömung die anderen Organoide zu den unbesetzten TAs (Film S1). Jeder TA besteht aus einer Staging-Kammer (SC), gefolgt von einer Immobilisierungskammer (IC) (Abb. 2c). Die SCs haben die gleiche Höhe wie der Hauptbereich, um während der anfänglichen Organoidbelastung minimalen Widerstand auszuüben. Anschließend wandern die Organoide in ICs mit reduzierter Höhe, die eine leichte Kompression und Abflachung der Organoide ermöglichen. Die IC-Breite (650 µm) ist größer als die der SCs (430 µm), um etwaige Ausdehnungen zu berücksichtigen, die durch diese vertikale Kompression entstehen können. Die resultierende Haftreibung sichert die Organoide an Ort und Stelle und macht sie während der schnellen motorisierten Bildgebung stationär. Die IC-Abmessungen bieten Platz für Organoide unterschiedlicher Größe, sofern sie in den IC gelangen können. Organoide mit Durchmessern, die größer als die Breite von SCs sind, dringen üblicherweise nicht in die ICs ein und werden durch leichte seitliche Kompression der SC-Seitenwände an Ort und Stelle gehalten, sodass sie dennoch für die Bildgebung immobilisiert werden können.

ICs sind über einen schmalen Kanal mit der Austrittskammer verbunden, der verhindert, dass Organoide aus den ICs austreten (Abb. 2c und ergänzende Abbildung S4). Die Austrittskammer ist über einen 71 mm langen Serpentinenkanal mit reduzierter Höhe (100 µm) mit dem Ausgang verbunden. Dieses Design bietet den notwendigen hydraulischen Widerstand, um die erforderlichen niedrigen Durchflussraten im Chip zu kontrollieren und aufrechtzuerhalten. Wir haben die Höhenreduzierung im breiten Teil der Austrittskammer implementiert, um zu verhindern, dass kleine Ansammlungen von Zelltrümmern, die aus den ICs austreten könnten, den Austrittskanal verstopfen (Abb. 2c und ergänzende Abbildung S4).

Mehrere Organoide, die in zwei benachbarten TAs untergebracht sind, können in ein einziges FOV des 10 × Objektivs (1,5 × 1,5 mm2) passen, was die Abbildung von mindestens zwei Organoiden pro FOV (mit mindestens einem Organoid pro TA) erleichtert. Da die TAs die Organoide an bekannten Orten an Ort und Stelle halten, entfällt mit dem OrganoidChip die umständliche Aufgabe des wiederholten Scannens eines gesamten Bohrlochs, um die Proben zu lokalisieren, was sich bei größeren Bildschirmen als vorteilhaft erweist.

Der OrganoidChip arbeitet mit einem druckgesteuerten Fluss, im Gegensatz zur Verwendung konstanter Flussraten (z. B. einer Spritzenpumpe), um sicherzustellen, dass die Flussrate abnimmt, wenn der hydraulische Widerstand im Chip steigt (Abb. 2a). Wenn alle TAs mit Organoiden besetzt sind, kann es zu einem Druckaufbau kommen, der sie in einem durchflussgesteuerten System möglicherweise einer unerwünscht hohen Scherspannung aussetzt. Daher haben wir einen druckgesteuerten Fluss verwendet, der die Flussrate innerhalb des Chips anpassen kann, wenn die TAs mit Organoiden beladen werden. Sobald alle TAs mit Organoiden beladen sind, wird es immer noch eine geringe Strömungsgeschwindigkeit um die Organoide geben, um einen ausreichenden Nährstoffaustausch zu gewährleisten.

Wir haben ein Ladeverfahren entwickelt, das den spezifischen Eigenschaften jedes Organoidtyps Rechnung trägt. Zum Beladen wurde der mit der Oberseite des Glasfasses verbundene Schlauch entfernt und Organoide in das Glasfasse pipettiert. Abhängig von der Größe der verfügbaren Organoide haben wir durchschnittlich etwa 8 Organoide geladen. Wir haben die Herzorganoide von den Kammerobjektträgern auf den Chip übertragen, indem wir sie ohne Strömung am Boden des Zylinders absetzen ließen. Anschließend wurden die Organoide vorsichtig mit Drücken von bis zu 0,15 bar in die TAs geleitet, was einer maximalen Flussrate von ~ 13 µl/min pro TA entspricht. Unter diesen Flussraten beobachteten wir eine vernachlässigbare oder keine Zellablösung aus den Organoiden, was darauf hindeutet, dass die ausgeübte Scherspannung für die Organoide physikalisch nicht schädlich war. Abbildung 3a zeigt einen OrganoidChip mit einem einzelnen Herzorganoid, der jeden der sechs TAs füllt.

Leistungscharakterisierung von OrganoidChips. (a, b) Repräsentative Bilder, die Herzorganoide (a) und Darmorganoide (b) zeigen, die gleichmäßig zwischen den TAs des Chips verteilt waren. (c) Die Einfangeffizienz wird als Anzahl der gefüllten TAs im Verhältnis zur Gesamtzahl der TAs (dh 6) angegeben. Wir haben 11 verschiedene Sätze von Chip-Experimenten für Herzorganoide und 8 für Darmorganoide durchgeführt. Die Einfangeffizienzen stiegen deutlich an, wenn unterstützte Ladeverfahren wie Flussumkehr und Chip-Titling verwendet wurden (n = 6 TAs pro Chip). (d) Schlagfrequenz der Herzorganoide als Funktion der Zeit beim Laden in den Chip. Die Daten zeigen keine signifikanten Veränderungen der Schlagraten nach 70 Minuten (n = 6 Organoide pro Zustand). Alle Vergleiche wurden unter Verwendung eines t-Tests bei zwei Stichproben unter Berücksichtigung der Varianzgleichheit durchgeführt. (e, f) Calcein AM- und EthD-1-Färbung der Off- und On-Chip-Herzorganoide (e) und Darmorganoide (f) (20 × Objektiv). (g) Lebensfähigkeitsverhältnisse der Organoide, die aus zwei verschiedenen Sätzen von Off- und On-Chip-Experimenten erhalten wurden, zeigen keine statistisch signifikanten Unterschiede (p = 0,40, Non-Chip = 18 und Non-Chip = 15 für Herzorganoide; p = 0,36). , Nicht-Chip = 8 und Nicht-Chip = 9 für Darmorganoide). Alle Maßstabsbalken repräsentieren 400 µm.

Das Beladen mit Darmorganoiden erwies sich als schwieriger, da diese beim Beladen mit Chips leicht aneinander haften konnten. Daher wurden die Darmorganoide nach dem Matrigel-Verdau in ihrer nativen 24-Well-Platte in eine Petrischale überführt und dann einzeln in das Glasrohr pipettiert, während ein hydrostatisch angetriebener Fluss angewendet wurde. Wenn ein Organoid auf den Boden des Fasses gravitiert und in den Chip eindringt, leitet die Strömung das Organoid zu einem leeren TA. Die Organoide wurden ständig nacheinander beladen, bis alle TAs mit mindestens einem Organoid gefüllt waren (Abb. 3b).

Abbildung 3c zeigt, dass die Einfangeffizienz von Organoiden beim ersten Laden in das Gerät durchschnittlich 68 % beträgt. Wir haben einen anderen Chip mit einer größeren Anzahl an TAs getestet und festgestellt, dass sich die Organoide aufgrund der großen Breite des Chips nicht gleichmäßig auf die TAs verteilten, was zu einer geringen Einfangeffizienz führte27. Daher haben wir die Gesamtbreite und den Verjüngungswinkel des Hauptbereichs verringert, indem wir die Anzahl der TAs auf sechs reduziert haben, was die Gesamteinfangeffizienz erhöht hat. Gelegentlich gelangten zwei oder mehr Organoide in einen einzelnen TA, während einige andere TAs leer blieben. Wir haben eine unterstützte Ladestrategie implementiert, um die Einfangeffizienz zu verbessern und das Risiko zu verringern, dass mehrere Organoide in einer einzigen Kammer gefangen werden. Nach der anfänglichen Beladung kehrten wir den Fluss um, um die Organoide in den Hauptbereich umzuleiten, neigten den Chip seitlich, um sie gleichmäßig auf die TAs zu verteilen, und nahmen den Vorwärtsfluss wieder auf, um Organoide in die leeren TAs zu leiten. Mit diesem unterstützenden Ladeverfahren stieg die durchschnittliche Einfangeffizienz sowohl für Darm- als auch für Herzorganoide deutlich auf 85 % (Abb. 3c).

Um die Auswirkung der Chip-Flow-Dynamik und des Ladevorgangs auf die Funktionalität von Herzorganoiden zu untersuchen, haben wir die Veränderungen der Organoid-Schlagfrequenzen mithilfe von Zeitraffer-Bildgebung gemessen. Ihre durchschnittlichen nativen Schlagraten außerhalb des Chips betrugen 55 Schläge pro Minute, gemessen in 96-Well-Platten mit dem BioTek Cytation 3. Als die Organoide anschließend in den OrganoidChip übertragen und auf die SCs verteilt wurden, verringerten sich ihre Schlagraten zunächst aufgrund des Pipettierens , vorübergehende Temperaturänderungen und Strömungseinwirkung während des Ladens. Doch innerhalb von 70 Minuten nach der Eingewöhnung in den Mini-Inkubator und ohne Fluss im Chip zeigten die Schlagraten der Organoide keine statistisch signifikanten Unterschiede zu ihren nativen Werten (Abb. 3d). Während der folgenden 80 Minuten blieben die Schlagraten in den SCs unverändert.

Anschließend haben wir die Organoide in die ICs verlegt. Selbst nach 30-minütiger Kompression in den ICs waren die Schlaggeschwindigkeiten der Organoide ähnlich denen, die außerhalb des Chips gemessen wurden. Um die isolierte Wirkung der Kompression auf Herzorganoide weiter zu untersuchen, führten wir ein separates Experiment an einer Petrischale durch. Konkret komprimierten wir die Organoide mit einem Deckglas auf eine Höhe von 230 µm und überwachten ihre Schlaggeschwindigkeiten über die Zeit (ergänzende Abbildung S5). Die Ergebnisse zeigten, dass die Schlagraten komprimierter Organoide in weniger als 20 Minuten das Niveau vor der Kompression erreichten, was mit unseren Beobachtungen auf dem Chip übereinstimmt.

Als nächstes testeten wir, ob das Laden und Fließen von Organoiden in den Chip deren Lebensfähigkeit beeinflusst. Wir haben Organoide sowohl außerhalb als auch auf dem Chip gefärbt und abgebildet. Die außerhalb des Chips abgebildeten Organoide dienten als Kontrollen.

Die Abb. 3e, f zeigen repräsentative Bilder von lebenden und toten gefärbten gesunden Organoiden. Die Lebensfähigkeitsverhältnisse, berechnet unter Anwendung von Gl. 4 auf lebenden/toten Bildern zeigen keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Off- und On-Chip-Organoiden (Abb. 3g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Chip-Beladungs- und Immobilisierungsprozesse keine nennenswerten nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von Organoiden haben. Darüber hinaus verdeutlichen diese Ergebnisse, dass unser Gerät neben der Abbildung von Organoiden auch die Färbung ermöglicht. Trotz der zusätzlichen Prozesse, denen die Darmorganoide unterzogen wurden, wie zum Beispiel die Pipettier- und Resuspensionsprozesse, die zum Auflösen des Matrigels für die On-Chip-Bildgebung erforderlich sind, unterscheiden sich ihre Lebensfähigkeitsverhältnisse nicht wesentlich von denen, die außerhalb des Chips abgebildet wurden. Diese Ergebnisse bestätigen weiterhin, dass die zusätzlichen Schritte, die für das Chip-Laden erforderlich sind, auch nicht schädlich für die Zellen sind.

Wir haben die Leistung des OrganoidChip bei der Beurteilung der dosisabhängigen Toxizitätsreaktion von Organoiden mithilfe von Lebend- und Totbildgebung bewertet. Die Abbildungen 4a,b zeigen repräsentative Hellfeld- und Lebend-/Tot-Fluoreszenzbilder von Organoiden, die mit DOX in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt wurden. Die meisten Organoide wurden erfolgreich in den ICs immobilisiert. Da Darmorganoide unabhängig von der DOX-Konzentration anfälliger für Agglomeration waren, hafteten gelegentlich zwei oder mehr von ihnen aneinander und verblieben als große Klumpen in den SCs (Behandlungsfälle mit 0,1 und 1,0 µM, dargestellt in Abb. 4a). Bei hohen DOX-Konzentrationen waren die Herzorganoide deutlich kleiner (< 350 µm) und schienen aneinander zu haften, wie im Fall von 10 µM in Abb. 4b zu sehen ist. Wir spekulieren, dass das Ablösen toter Zellen von der Oberfläche der Organoide (beobachtet bei der DOX-Exposition außerhalb des Chips) zur Größenverringerung beitrug, während Änderungen in den Oberflächeneigenschaften und das Vorhandensein freier DNA aus den dissoziierenden Zellen eine Agglomeration der Organoide verursachten. Das Vorhandensein mehrerer Organoide in den TAs (in ICs oder SCs) hatte keinen negativen Einfluss auf die Funktionalität des Chips. Organoide wurden erfolgreich abgebildet, während sie in beiden Kammern der TAs immobilisiert waren.

Dosisabhängige Lebensfähigkeitsanalyse der Darm- und Herzorganoide nach 48 Stunden DOX-Behandlung. Beispielbilder der gefärbten Darm- (a) und Herzorganoide (b) im OrganoidChip. Die mit Konzentrationen von 0,3 und 2 µM behandelten Darmorganoide wurden in den Chips mit kürzerem Verbindungskanaldesign abgebildet. (c) Die Lebensfähigkeitskurven für die Ergebnisse der Lebend- (Calcein AM) und toten (EthD-1) Färbung außerhalb und auf dem Chip. Der IC50-Wert für die Off- und On-Chip-Bedingungen beträgt 0,22 bzw. 0,18 µM für die Darmorganoide und 0,73 bzw. 0,69 µM für die Herzorganoide. Die Datenpunkte werden mit einer S-Kurven-Anpassung dargestellt (n ≥ 5 Organoide pro Bedingung); (d) Hellfeld (I) und maximale Intensitätsprojektion (II) der konfokalen Z-Bilder von Organoiden, die mit DOX-Konzentrationen von 0,3 µM (Darmorganoid) und 0,5 µM (Herzorganoid) behandelt wurden, gefärbt mit Hoechst (blau), EthD-1 (Rot) und Calcein AM (Grün) (10 × Objektiv); Die orangefarbenen (III) und roten (IV) Bereiche des Herzorganoids wurden mit einem 40-fach-Objektiv neu abgebildet und ihre Projektionen maximaler Intensität sind in den Teilbildern III und IV dargestellt. Maßstabsbalken für 10-fache Bilder (in den Abbildungen a, b und d) und 40-fache Bilder (in Abbildung d) betragen 400 µm bzw. 100 µm.

Die Lebend-/Tot-Dosis-Wirkungs-Kurven wurden durch Anpassen eines sigmoidalen Imax-Modells (S-Kurve) an Lebensfähigkeitsdatenpunkte erhalten (Abb. 4c). Insgesamt war die Form der angepassten S-Kurve bei Herzorganoiden steiler als bei Darmorganoiden. Die Lebensfähigkeit beginnt bei Darmorganoiden im Bereich von 10 s nM zu sinken, während der Abfall bei Herzorganoiden im Bereich von 100 nM beginnt, was bedeutet, dass Darmorganoide empfindlicher auf die DOX-Behandlung reagieren. Beispielsweise haben Herzorganoide, die mit 0,1 µM DOX behandelt wurden, geringfügige Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen und diese Organoide zeigen nahezu die gleiche Lebensfähigkeit wie der mit DMSO behandelte Zustand. Andererseits reduziert die Behandlung von Darmorganoiden mit der gleichen DOX-Konzentration ihre Lebensfähigkeit auf ~ 65 %. Bei Behandlungen mit höheren DOX-Konzentrationen, beispielsweise 2 µM, sinkt die Lebensfähigkeit beider Arten von Organoiden deutlich auf unter 10 %.

Basierend auf diesen Kurven haben wir festgestellt, dass die DOX-IC50-Werte außerhalb und auf dem Chip 0,22 bzw. 0,18 µM für Darmorganoide und 0,73 bzw. 0,69 µM für Herzorganoide betragen (Ergänzungstabelle S3). Diese Ergebnisse deuten darüber hinaus darauf hin, dass Darmorganoide empfindlicher auf die DOX-Behandlung reagieren als Herzorganoide und bei niedrigeren Konzentrationen Toxizität zeigen. Die angepassten Dosis-Wirkungs-Kurven für die Off- und On-Chip-Tests unterscheiden sich statistisch nicht (Ergänzungstabelle S4), was darauf hinweist, dass die Beladungs-, Immobilisierungs- und Färbeprozesse auf dem OrganoidChip die Lebensfähigkeitsergebnisse für die DOX-behandelten Organoide nicht verändern .

In der Literatur gibt es nur eine sehr begrenzte Anzahl von Studien, die auf der Lebensfähigkeit basierende IC50-Werte für DOX-behandelte Darmorganoide unter Verwendung menschlicher Zellen präsentieren, und keine für Organoide auf Hundebasis. Eine der am Menschen durchgeführten Studien analysierte Bilder (4 × objektiv) von Mit Phalloidin-FITC und Hoechst gefärbte Zellen, um die Lebensfähigkeit der Zellen festzustellen28. Wir schätzten ihre IC50-Werte auf weniger als 1 µM, vergleichbar mit unseren Ergebnissen. Über die Lebensfähigkeitsanalyse von DOX-behandelten Herzorganoiden wurde mit verschiedenen Methoden berichtet, wie z. B. Absorptionstests29, Lebend-/Tot-Fluoreszenzfärbung3, Durchflusszytometrie von von Organoiden dissoziierten Zellen30 und Parametern der Schlagkinetik (z. B. Schlagrate, Flächenänderung usw.). )13,31. Allerdings wurden in vielen dieser Studien nicht genügend DOX-Konzentrationen getestet, um Expositions-Wirkungs-Kurven zu erstellen, und konnten letztendlich keine IC50-Werte schätzen. In den Studien, in denen IC50-Werte angegeben wurden, stützten sie sich auf Schlagparameter. Richards et al. berichteten über einen IC50-Wert für Herzorganoide, die 48 Stunden lang DOX ausgesetzt waren, gemessen anhand der fraktionellen Flächenveränderung der Organoide während des Schlagens. Sie fanden einen IC50-Wert von 0,41 µM, vergleichbar mit unseren Ergebnissen.

Um die Fähigkeit des OrganoidChips zu zeigen, eine Bildgebung mit höherer Auflösung zu ermöglichen, verwendeten wir konfokale Mikroskopie für mehrere auf dem Chip immobilisierte Organoide. Repräsentative Bilder zeigen eine verbesserte optische Segmentierung und die Fähigkeit, einzelne Zellen innerhalb eines Organoids aufzulösen (Abb. 4d). Die kolokalisierten EthD-1- und Hoechst-gefärbten Kerne sind auflösbar und können möglicherweise zur Erhöhung der Genauigkeit von Lebensfähigkeitsmessungen verwendet werden. Die zukünftige Implementierung der 3D-Segmentierung mithilfe KI-gestützter Algorithmen in der Analysepipeline kann genauere Schätzungen der Zelllebensfähigkeit in größeren Bildschirmen liefern.

Als nächstes haben wir die Wirkung der DOX-Behandlung auf die Schlagkinetik von Herzorganoiden gemessen. Dazu haben wir uns auf die Kalziumfluoreszenzbildgebung verlassen, da sich gezeigt hat, dass sie eine gute Annäherung an die Aktionspotentiale der Kardiomyozyten darstellt32. Die Calcium-Bildgebung erwies sich für Schlag- und Kontraktionsparameter als vorteilhaft, da kleinere Schlaganteile auf Hellfeldbildern nicht unbedingt erkannt werden können, insbesondere wenn Organoide infolge einer medikamentösen Behandlung beeinträchtigt wurden.

Bei der Beurteilung der Arzneimittelwirkungen beobachteten wir ein gewisses Maß an Variabilität im spontanen Kontraktionsverhalten und der Schlagkinetik zwischen Herzorganoiden. Eine solche Variabilität verzerrt häufig jeden gemittelten Parameterwert über Organoide hinweg und spiegelt nicht die Auswirkung der Behandlungsbedingungen auf die Gesundheit von Organoiden wider. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir die Schläge jedes einzelnen Organoids außerhalb und auf dem Chip verfolgt. Die Ergebnisse der medikamenteninduzierten Funktionalität werden daher als Durchschnittswerte der fraktionellen Änderungen der Schlagkinetikparameter jedes einzelnen Organoids angegeben, die 48 Stunden nach der Behandlung sowohl auf dem Kammerobjektträger als auch auf dem Chip im Verhältnis zu seinem Wert vor der Behandlung gemessen wurden (Gl. 3).

Bei der Beurteilung der Kardiotoxizität untersuchten wir die gut dokumentierten Schlagkinetikparameter BR und ΔF/F0. Darüber hinaus schlagen wir zwei neue Parameter vor: den Schlagzeitprozentsatz (BT75) und die Schlagleistung (FBT75), um weniger verstandene Aspekte der Organoid-Schlagkinetik zu bewerten (Gleichungen 1 und 2). Durch Anpassen von S-Kurven an die dosisabhängigen Reaktionen von Organoiden haben wir die IC50-Werte der Off- und On-Chip-Bedingungen für jeden dieser Parameter geschätzt (Abb. 5).

Dosis-Wirkungs-S-Kurven verschiedener schlagender kinetischer Parameter von Herzorganoiden basierend auf ihren fraktionellen Änderungen (dh Δ(X)). Wir präsentieren die Kurven der fraktionalen Änderungen für die Off- und On-Chip-Beat-Raten (BR) (a), ΔF/F0 (b), den Beating-Time-Prozentsatz (BT75) (c) und die Beating-Leistung (FBT75). (D). Wir haben eine S-Kurve an die Daten angepasst und den IC50-Wert für die Off- und On-Chip-Bedingungen ermittelt, wie in den Diagrammen zusammengefasst. Off- und On-Chip-Kurven sowie Kurven verschiedener Parameter ließen sich gut miteinander vergleichen, ohne statistisch signifikante Unterschiede (F-Test). n ≥ 5 Organoide pro Bedingung.

Interessanterweise sind alle IC50-Werte, die aus auf dem Chip gemessenen Schlagkinetikparametern geschätzt werden, nahezu identisch mit ihren Gegenstücken außerhalb des Chips und mit den in der Literatur angegebenen Werten (Abb. 5 und Ergänzungstabelle S3)31. Darüber hinaus unterscheiden sich die Off- und On-Chip-S-Kurven-Anpassungen statistisch nicht (F-Test, Ergänzungstabelle S4). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Toxizitätswerte, die durch Schlaganalysen auf dem Chip ermittelt wurden, den Messungen außerhalb des Chips ähneln, was ein weiterer Beweis dafür ist, dass der OrganoidChip keine Verzerrung bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit oder Funktionalität von Organoiden hervorruft. Darüber hinaus sind die geschätzten Dosis-Wirkungs-Kurven für alle Parameter der Schlagkinetik einander ähnlich (F-Test, Ergänzungstabelle S5). Darüber hinaus liegen ihre resultierenden IC50-Werte innerhalb der Grenzen des Standardfehlers der aus der Lebensfähigkeitsanalyse erhaltenen IC50-Werte (Ergänzungstabelle S3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Calcium-Bildgebung austauschbar mit der Fluoreszenz-Live/Dead-Bildgebung verwendet werden kann, um IC50-Werte zu erhalten.

Wir haben ein LabVIEW-Programm entwickelt, um die Kamera und unseren Weitfeld-Mikroskoptisch für schnelle und automatisierte Bildgebung und Tischbewegungen zu steuern. Das Programm bewegt die Bühne über drei FOVs auf dem Chip, die jeweils zwei TAs (entsprechend zwei Organoiden) enthalten, um die sechs TAs mit unserer Hochgeschwindigkeitskamera abzubilden. Gemäß Tabelle 1 erreichten wir Bildgebungszeiten von 10,4 und 70,0 s für die On- und Off-Chip-Bildgebung von Calciumtransienten und 5,5 und 89,5 s für die On- und Off-Chip-Live- und Dead-Bildgebung von zwei Herzorganoiden. Durch die Eliminierung der erforderlichen Zeiten für das Auffinden eines Organoids in einem Bohrloch, den Wechsel zu einem Objektiv mit hoher NA und die Lokalisierung der richtigen ROIs und Fokusebenen für die On-Chip-Bildgebung konnte die Bildgebungszeit erheblich verkürzt werden (Tabelle 1). Die Messungen zeigen, dass der OrganoidChip ein vielversprechendes Werkzeug für die schnelle Bildgebung ist, um die Beurteilung der Arzneimitteltoxizität zu beschleunigen, wenn er für einen höheren Durchsatz ausgelegt ist, wie später in diesem Manuskript erläutert wird.

Es fehlen Geräte, die eine robuste Organoidimmobilisierung für hochauflösende Bildgebung ermöglichen und auf eine Konfiguration mit hohem Durchsatz skaliert werden können. Für die Bildgebung mit hohem Durchsatz und hoher Auflösung müssen Organoide vollständig immobilisiert werden, was durch die Einbettung von Organoiden in Hydrogele erreicht werden kann. Allerdings weist die Verwendung von Hydrogelen Einschränkungen auf, wie z. B. zufällige Abstände der Organoide vom Ziel. Um diese Herausforderung zu meistern, haben Cambra et al. entwickelten ein dreischichtiges Hydrogel-Sandwich für die Kultivierung von Darmorganoiden10. Unter Verwendung von Standardplatten mit 12 Vertiefungen wurden Organoide in einem engen Abstandsbereich vom Plattenboden gezüchtet. Andere entwickelten eine Immobilisierungsmethode für Gehirnorganoide, indem sie sie in ein Hydrogel einbetteten und ihre Höhe zwischen einem Deckglas und entweder einer porösen Membran11 oder einem 3D-gedruckten Platteneinsatz12 begrenzten. Diese Methoden eliminieren das Abdriften von Organoiden und ermöglichen so eine hochauflösende und zeitrafferartige Bildgebung über mehrere Tage hinweg. Sie erfordern jedoch auch eine umständliche Geräteherstellung und Organoidbeladung und lösen vor allem nicht die Probleme im Zusammenhang mit der Verteilung von Organoiden in zufälligen FOVs, was für Formate mit hohem Durchsatz möglicherweise nicht förderlich ist.

Alternativ können Organoide auf mikrostrukturierten PEG- und Matrigel-Schichten kultiviert werden, um immobilisierte organoidähnliche Strukturen zu erzeugen13. Obwohl diese Methode die Organoide in einem festen Sichtfeld darstellt und auf eine Hochdurchsatzkultur skalierbar ist, erzeugt sie nur teilweise dreidimensionale Organoide, deren Fähigkeit zur Nachahmung von Organstruktur und -funktion eingeschränkt ist14.

Durch die Einbindung von Organoiden in mikrofluidische Technologien sind nützliche Plattformen entstanden, die Standardmedikamentenbehandlungen15 mit anspruchsvollen Assays16,17 implementieren können, um die Probenüberwachung und Endpunktanalyse durch Bildgebung7,18 zu erleichtern. Obwohl aktuelle mikrofluidische Geräte viele komplizierte Aspekte von Organoiden untersuchen können, sind viele aufgrund umständlicher Prozesse wie dem Versiegeln oder Zusammenbauen des Chips nach der Einführung der Organoide11,19,20 und aufgrund schwer umzusetzender Designmerkmale nicht auf hohe Durchsätze skalierbar herzustellen oder kosteneffiziente Herstellungsverfahren (z. B. Spritzguss) nicht zu ermöglichen. Einige hochmoderne Mikrofluidikgeräte haben es geschafft, die Immobilisierung von Organoiden mithilfe von Hydrogelen zu erleichtern17,20,21. Trotz der herausragenden Fähigkeiten dieser Geräte bleibt es bei den meisten von ihnen eine Herausforderung für die hochauflösende Bildgebung, das gewünschte Sichtfeld und die gewünschte Fokusebene zu finden. Aeby et al. befassten sich mit der zufälligen Verteilung von Organoiden, indem sie eine hängende Hydrogel-Tröpfchenkultur in einem Mikrofluidikgerät verwendeten, das über neun Tage lang perfundiert werden konnte21. Obwohl das Gerät hervorragende Untersuchungen mit Sphäroiden aus Dickdarm und Leber durchführte, sind diese festen Hydrogele möglicherweise kein geeignetes Bett für die Untersuchung bestimmter Arten von Organoiden, beispielsweise spontan schlagender Herzorganoide. Noch wichtiger ist, dass die Zugabe und Entfernung der fluoreszierenden Farbstoffe aus Hydrogelen ausschließlich auf der Farbstoffdiffusion beruht, was ein relativ langsamer Prozess sein kann, der durch die Porosität und Vernetzungsdichte des Hydrogels reguliert wird.

Selbst wenn der OrganoidChip mit Organoiden beladen ist, enthält er keine Hydrogelmaterialien, wodurch alle zuvor diskutierten Komplikationen im Zusammenhang mit Hydrogel-gestützten Methoden vermieden werden, die zu langsameren und kleineren Tests führen. Um die Bildgebungsgeschwindigkeit weiter zu erhöhen und Hochdurchsatz-Bildgebung zu implementieren, kann unser Chip als Baustein für den Entwurf einer 96-Well-Platte dienen, in der jedes Well einem OrganoidChip entspricht, ähnlich der Hochdurchsatz-vivoChip-Plattform, die wir zuvor entwickelt haben33 . Wir spekulieren, dass die durch den automatisierten Einsatz eines solchen Multiwell-Chips eingesparte Zeit groß angelegte Screenings ermöglichen wird, die in kurzer Zeit durchgeführt werden können. Unsere Schätzungen deuten darauf hin, dass die Summe der Bildgebungszeiten für Kalziumtransienten und lebende und tote Bildgebung von 96 × 6 Organoiden 2 Stunden gegenüber 25 Stunden für die hypothetische 96-Well-OrganoidChip-Platte im Vergleich zu sechs herkömmlichen 96-Well-Platten mit flachem Boden und jeweils einem Organoid beträgt bzw. gut (siehe Ergänzungstabelle S6). Durch die gleichzeitige Abbildung von zwei Organoiden auf dem Chip konnte eine Zeitverkürzung um eine Größenordnung erzielt werden. Dadurch entfiel die Zeit, die mit dem Auffinden von Organoiden in einer Vertiefung oder einem Kammerobjektträger, dem Einbringen und Entfernen von Farbstoffen und der Neubestimmung der Position der Organoide nach der Farbstoffinkubation verbunden war. Diese Zeitersparnis macht Hochdurchsatz-Screening für zeitkritische Tests wie klinische Anwendungen im Zusammenhang mit personalisierter Medizin möglich und zeigt, dass unsere Plattform eine entscheidende und unterstützende Technologie für die Organoid-Gemeinschaft und darüber hinaus ist.

Abschließend betonen wir, dass die Abbildung von Kalziumtransienten spontan kontrahierender Herzorganoide eine Herausforderung darstellt, da der interessierende fluoreszierende Bereich bei der Abbildung außerhalb des Chips einer erheblichen Bewegung unterliegt (Ergänzungsvideo S2). Um denselben interessierenden Bereich mithilfe von Kreuzkorrelationsmetriken der Position des Organoids zu überwachen, ist eine umfangreiche Nachbearbeitung erforderlich, wenn sich das Organoid noch im Sichtfeld befindet. Wenn sich das Organoid außerhalb des Sichtfelds bewegt, gehen die Kalziumtransientendaten bei herkömmlichen Bildgebungsmethoden häufig verloren. Da wir den OrganoidChip als Baustein für ein Gerät mit höherem Durchsatz sehen, wird sich die Minimierung von Nachbearbeitungsschritten zur Berücksichtigung von Organoidbewegungen während der Zeitrafferbildgebung als Zeit- und Rechenleistungseinsparung erweisen.

Wir haben ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, den OrganoidChip, der die Immobilisierung und Färbung von Organoiden in einem Gerät ermöglicht und so eine schnelle und verwacklungsfreie Bildgebung ermöglicht, die den Probenverlust während der Assay-Verabreichung minimiert. Dieses Gerät überwindet die Einschränkungen bestehender HCI-Plattformen für die Organoid-Bildgebung und ist sowohl mit hochauflösender Weitfeld- als auch mit konfokaler Mikroskopie kompatibel. Wir demonstrieren diese einzigartigen Fähigkeiten des OrganoidChip, indem wir HCI an DOX-behandelten Darm- und Herzorganoiden zur dosisabhängigen Toxizitätsbewertung durchführen.

Das einzigartige Design des OrganoidChip ermöglicht die Immobilisierung von Organoiden, um unerwünschte Bewegungen während der schnellen motorisierten Bildgebung zu verhindern und so das Risiko zu eliminieren, dass ein Organoid aus dem Fokus und dem Sichtfeld driftet. Vorab festgelegte Standorte der Immobilisierungskammern machen die umständliche und zeitaufwändige Suche nach Organoiden in einem gesamten Bohrloch oder Hydrogelpad überflüssig. Auch für die volumetrische Abbildung von Organoiden ist unser Chip von Vorteil. Bei größeren Organoiden ermöglicht die begrenzte Höhe der TAs eine Bildgebung mit weniger Z-Schnitten. Insbesondere die den Darmorganoiden innewohnenden Krypten- und Zottenstrukturen erfordern viele optische Schnitte, um die Organoidmorphologie vollständig abzubilden (ergänzende Abbildung S6). Durch die Aufnahme weniger Bilder wird der Zeitaufwand reduziert und der Datenspeicherplatz minimiert.

Wir haben Organoide erfolgreich mit dem OrganoidChip geladen, immobilisiert, gefärbt und abgebildet und gezeigt, dass diese Prozesse die Lebensfähigkeit oder Funktionalität der Organoide nicht beeinträchtigen. Insbesondere untersuchten wir Herz- und Darmorganoide, die dosisabhängig 48 Stunden lang DOX, einem Standard-Chemotherapeutikum, ausgesetzt waren. Es wurde festgestellt, dass die Auswirkungen der DOX-Toxizität auf die Lebensfähigkeit beider Organoidtypen und die Funktionalität von Herzorganoiden bei den Off- und On-Chip-Tests nahezu identisch sind. Die geschätzten IC50-Werte ähnelten veröffentlichten Daten aus der Literatur, insbesondere denen, die mithilfe einer bildbasierten Analyse ermittelt wurden4,28. In diesen Studien wurde eine Mikroskopie mit niedriger Auflösung (d. h. ein 4-fach-Objektiv) verwendet, um Bildunschärfen zu reduzieren und zeitraubende Scans zur Lokalisierung einzelner Organoide innerhalb eines Bohrlochs zur Beurteilung der Lebensfähigkeit zu vermeiden. Eine Bildgebung mit höherer Auflösung (d. h. ≥ 20 × konfokale Bildgebung) könnte möglicherweise eine genauere und empfindlichere Erkennung arzneimittelinduzierter zytotoxischer Wirkungen ermöglichen, die mit dem OrganoidChip implementiert werden kann.

Aufgrund der Agglomerationsneigung der Organoide und der stochastischen Verteilung der Organoide unter den TAs erfordert der Ladevorgang manuelles Kippen und Flussumkehr, um eine hohe Einfangeffizienz zu erreichen. Obwohl solche manuellen Eingriffe für kleine Studien machbar sind, sind sie für groß angelegte Studien mit einem Multiwell-Chip nicht praktikabel. Dieser Herausforderung kann begegnet werden, indem der Chip während des Ladevorgangs gleichmäßig auf einer automatisierten Wippe gekippt wird, um eine bessere Organoidverteilung unter den TAs zu fördern. Andernfalls können wir den Chip auch mit einem einzigen TA pro Well in einem 384-Well-Plattenformat entwerfen, um die Agglomeration von Organoiden zu verhindern, da nur ein Organoid pro Chip vorhanden ist und der Einfangprozess somit deterministisch ist.

Die Abmessungen unseres Geräts sind so konzipiert, dass sie mit kostengünstigen Herstellungsmethoden wie Heißprägen und Spritzgießen kompatibel sind. Diese Merkmale können mittels Elastomerübertragung vom SU-8/Si-Wafer in eine Heißprägeform reproduziert werden. Die minimale Merkmalsgröße der Mikrokanäle liegt in der Größenordnung von ~ 0,1 mm, um sicherzustellen, dass die Merkmale des Chips mit dem CNC-Mikrofräsen kompatibel sind, was ihn zu einem idealen Kandidaten für die zukünftige Ausweitung der Produktion durch Spritzguss macht.

Zukünftige Versionen von OrganoidChip könnten Vertiefungen für die Kultivierung von Organoiden, insbesondere Herzorganoiden, in das Bildgebungsgerät integrieren. Durch die automatische Einführung von Organoiden in die Einfangbereiche werden die mit dem Pipettieren während des Organoidtransferprozesses verbundenen Herausforderungen erheblich reduziert33. Kultivierte Organoide können auch optisch gereinigt, fixiert, immungefärbt, auf dem Chip abgebildet und zur weiteren Analyse vom Chip entnommen werden.

Im Großen und Ganzen deuten unsere Daten darauf hin, dass der OrganoidChip viele der Mängel der aktuellen Technologien zur Bildgebung von Organoiden beseitigt. Darüber hinaus unterstreicht der jüngste Modernisierungsgesetz 2.0 der FDA, der die Verwendung von Organoiddaten für die IND-Einreichung neuartiger Arzneimittel anstelle von In-vivo-Tierversuchen genehmigt, das Potenzial des OrganoidChips bei der präklinischen Bewertung therapeutischer Arzneimittelkandidaten.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken den National Institutes of Health (NIH) für die finanzielle Unterstützung mit dem SBIR-Stipendium des National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), R43-ES029890, das an vivoVerse, Inc. (früher firmierend als Newormics) vergeben wurde , GMBH).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Khashayar Moshksayan und Anirudha Harihara.

Fakultät für Maschinenbau, University of Texas at Austin, Austin, TX, USA

Khashayar Moshksayan, Anirudha Harihara, Sudip Mondal, Evan Hegarty und Adela Ben-Yakar

Abteilung für Biomedizintechnik, University of Texas at Austin, Austin, TX, USA

Janet Zoldan und Adela Ben-Yakar

Abteilung für klinische Veterinärwissenschaften, Iowa State University, Ames, IA, USA

Todd Atherly, Dipak K. Sahoo, Albert E. Jergens und Karin Allenspach

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften, Iowa State University, Ames, IA, USA

Jonathan P. Mochel

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KM, SM, EH und AB haben den Chip entworfen. KM optimierte das Design und fertigte die Chips. KM und AH führten die Off- und On-Chip-Experimente durch, präparierten die Darmorganoide und analysierten die Daten. AH hat die Herzorganoide vorbereitet. TA, DKS, AJ, JPM und KA lieferten die Darmorganoidkulturen. KM, AH, JZ und AB haben den Manuskriptentwurf geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Adela Ben-Yakar.

AJ, JPM und KA sind Mitbegründer von 3D Health Solutions, Inc., einem kleinen Biotechnologieunternehmen, das auf Organoiden von Hunden basierende Tests für präklinische Arzneimitteltests entwickelt. AB, SM und EH sind Mitbegründer von vivoVerse, Inc., einem Life-Science-Unternehmen, das Instrumente und Dienstleistungen für toxikologische Tests mit neuen Ansatzmethoden (NAMs) bereitstellt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Moshksayan, K., Harihara, A., Mondal, S. et al. OrganoidChip ermöglicht eine hydrogelfreie Immobilisierung für eine schnelle und verwacklungsfreie Abbildung von Organoiden. Sci Rep 13, 11268 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38212-8

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Eingegangen: 3. Mai 2023

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 12. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38212-8

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