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Oct 21, 2023

Kompakter und automatisierter eDNA-Probenehmer für die In-situ-Überwachung von Meeresumgebungen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 5210 (2023) Diesen Artikel zitieren 3147 Zugriffe auf 2 Altmetric Metrics-Details Die Verwendung von Umwelt-DNA (eDNA) zur Überwachung der Biodiversität in aquatischen Umgebungen ist

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 5210 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Der Einsatz von Umwelt-DNA (eDNA) zur Überwachung der Biodiversität in Gewässern entwickelt sich zu einer effizienten und kostengünstigen Alternative zu anderen Methoden wie der visuellen und akustischen Identifizierung. Bis vor kurzem erfolgte die eDNA-Probenahme hauptsächlich durch manuelle Probenahmemethoden; Mit dem technologischen Fortschritt werden jedoch automatisierte Probenehmer entwickelt, um die Probenahme einfacher und zugänglicher zu machen. In diesem Artikel wird ein neuer eDNA-Probenehmer beschrieben, der sich selbst reinigen und mehrere Proben erfassen und aufbewahren kann, alles in einer einzigen Einheit, die von einer einzelnen Person eingesetzt werden kann. Der erste Feldtest dieses Probenehmers fand im Bedford Basin, Nova Scotia, Kanada, zusammen mit Parallelproben statt, die mit der typischen Niskin-Flaschensammlung und der Nachsammlungsfiltrationsmethode entnommen wurden. Beide Methoden waren in der Lage, die gleiche mikrobielle Gemeinschaft im Wasser zu erfassen, und die Anzahl repräsentativer DNA-Sequenzen korrelierte gut zwischen den Methoden mit R\(^{2}\)-Werten im Bereich von 0,71–0,93. Die beiden Sammelmethoden ergaben die gleichen Top-10-Familien in nahezu identischer relativer Häufigkeit, was zeigt, dass der Probenehmer in der Lage war, die gleiche Gemeinschaftszusammensetzung häufiger Mikroben zu erfassen wie der Niskin. Der vorgestellte eDNA-Probenehmer bietet eine robuste Alternative zu manuellen Probenahmemethoden, ist für die Nutzlastbeschränkungen autonomer Fahrzeuge geeignet und erleichtert die dauerhafte Überwachung abgelegener und unzugänglicher Standorte.

Die zunehmende menschliche Aktivität in Gewässern hat zu Bedenken hinsichtlich anthropogener Auswirkungen geführt, die zu Problemen wie Hypoxie, Versauerung der Ozeane und Eutrophierung aufgrund einer erhöhten Nährstoffbelastung führen1. Diese Auswirkungen können das Wachstum bestimmter Organismen behindern, beispielsweise kalkbildender Meeresarten, deren Schalen und Skelette durch Versauerung beeinträchtigt werden können2, und das Wachstum anderer Arten fördern, einschließlich solcher, die schädliche Algenblüten (HABs) verursachen, die sowohl den Fischen als auch der menschlichen Wirtschaft schaden3. 4. Der Zeitrahmen dieser Veränderungen und ihrer daraus resultierenden Auswirkungen kann zwischen Stunden und Jahren liegen. Da jedes Ökosystem einzigartig ist, kann es schwierig sein, Veränderungen zu verfolgen, sodass zeitaufgelöste In-situ-Beobachtungen erforderlich sind, um Veränderungen richtig beurteilen zu können.

Biologische Überwachungsprogramme konzentrieren sich traditionell auf die manuelle Identifizierung wichtiger taxonomischer Gruppen von Interesse. Diese Programme können jedoch zeitaufwändig sein und erfordern eine spezielle Ausbildung in taxonomischer Identifizierung. In den letzten Jahren, da die Kosten für die DNA-Sequenzierung gesunken sind und die Nukleinsäuredatenbanken immer größer geworden sind, wird Umwelt-DNA (eDNA) zunehmend als Stellvertreter für die biologische Vielfalt in biologischen Überwachungsprogrammen verwendet5. Die Überwachung der eDNA umfasst die Untersuchung der gesamten in der Umwelt vorhandenen DNA6 und ist in mehrfacher Hinsicht vorteilhaft, da sie nicht invasiv ist und auf Mikrobiota und Metazoen gleichermaßen anwendbar ist, wobei eine sich schnell entwickelnde Reihe von Analysemethoden von der empfindlichen DNA-Extraktion bis zur Erkennung einzigartiger Barcode-Sequenzen7 verwendet wird. Es gibt zahlreiche Studien, die den Wert von eDNA für die Untersuchung der mikrobiellen Vielfalt belegen, angesichts der Bedeutung ihrer Rolle bei der Primärproduktion durch Phytoplankton und dem biogeochemischen Kreislauf abgestorbener organischer Substanz. Beispielsweise hat die Bioüberwachung von Mikrobiota in Aquakulturumgebungen gezeigt, dass eDNA nützlich ist, um die schnelle mikrobielle Reaktion auf Umweltstörungen zu erkennen und Managementstrategien für eine nachhaltige Aquakulturindustrie zu bewerten8,9,10. Darüber hinaus haben immer mehr Studien die wichtige Rolle aufgezeigt, die eDNA für die Umweltüberwachung der Artenvielfalt von Fischen11, die Verfolgung von Meeressäugetieren12 und andere Aspekte der Naturschutzbiologie13 spielen wird.

Aktuelle Methoden zur eDNA-Probenahme sind oft arbeitsintensiv und erfordern die Probenentnahme mit Niskin-Flaschen oder ähnlichen Geräten, gefolgt von separaten Filtrations- und Konservierungsschritten, oft unter Verwendung einer Peristaltikpumpe bzw. eines Gefrierschranks. Die manuellen Komponenten der eDNA-Probenahme und -Analyse schränken den Einsatz in abgelegenen Umgebungen oder in Umgebungen ein, in denen regelmäßig Proben entnommen werden müssen, und erfordern die Durchführung des Prozesses durch eine geschulte Person. Die Ausweitung der Anwendbarkeit von eDNA-Methoden auf anspruchsvollere Probleme erfordert eine Automatisierung, einschließlich der Entwicklung automatisierter Probenahmegeräte. Kürzlich entwickelte Probenehmer reichen von Einzelfiltersystemen bis hin zu komplexeren Mehrfiltersystemen, wobei sich die einzelnen Parameter wie Einsatzdauer, maximale Tiefenbewertung und verwendete Chemikalien/Konservierungsmittel unterscheiden. Eine repräsentative Liste aktueller eDNA-Probennehmer, sowohl im Handel erhältliche als auch Forschungsprototypen, ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Der Environmental Sample Processor (ESP) ist der fortschrittlichste und beherbergt beeindruckende 60 Filterpatronen; Allerdings sind die ESP-Probenehmer hauptsächlich in Forschungsstudien verblieben, ohne dass sie vollständig auf kommerzielle Arbeitsabläufe und Anwendungen übergegangen sind, wie z. B. die Verwendung durch Aquakulturbetreiber, den Einsatz in Stadthäfen, Windkraftanlagen usw. Dieser Probenehmer basiert auf einer Weiterentwicklung des bahnbrechenden ESP, ein vom Monterey Bay Aquarium Research Institute (MBARI) entwickelter In-situ-Probenehmer und DNA-Analysator. Diese vollständig tauchfähigen Analysegeräte wurden von 2001 bis 200924 entwickelt und als Generation 1 und Generation 2 bezeichnet. Hierbei handelte es sich um umfassende Labore unter Wasser, die Probenentnahme und DNA-Extraktion durchführten, um PCR-Mikrofluidikgeräte, Hybridisierungsarrays und Sandwich-Assays zu versorgen. Die ESP-Instrumente der 1. und 2. Generation kosten jedoch mehrere Hunderttausend Dollar und sind äußerst komplex in der Bereitstellung und Wartung, wobei die endgültigen Verträge typischerweise Millionen von Dollar betragen. Die neueste Instrumentengeneration von MBARI, Generation 3, verzichtete vollständig auf die integrierte Analyse und zielte darauf ab, eine Probensammlung mit Konservierung auf Unterwasserfahrzeugen durchzuführen, gefolgt von einer landgestützten Labor-Genomanalyse20.

Obwohl Kosten und Komplexität für die ESP-Generation 3 reduziert wurden, zielten neue und optimierte Probenehmer darauf ab, die Skalierbarkeit für die Sammlung von eDNA vor Ort weiter zu verbessern, darunter: der Subsurface Automated Sampler for eDNA (SASe), PolyWAG (Water Acquired Genomics) und der CLAM (Kontinuierliche Überwachung von Gewässern auf niedrigem Niveau). Die Preise für diese Systeme belaufen sich auf Tausende von Dollar, wodurch die automatisierte eDNA-Probenahme leichter zugänglich wird. Die meisten dieser optimierten Probenehmer verfügen über einen einzigen Filter, enthalten in der Regel keine Konservierungs- oder Reinigungsreagenzien und sind für kurzfristige Einsätze (stündlich, täglich) geeignet. Während einige über eine längerfristige Einsatzfähigkeit verfügen (SASe-Einheit verfügt über eine integrierte Konservierungsfunktion), fehlt vielen die Fähigkeit zur Selbstreinigung mit Säuren oder Bleichmitteln, noch spülen sie den Probeneinlass/-einlass, um Biofouling und Kreuzkontamination zu minimieren. Das polyWAG-System bietet 24 Filter mit integrierter Selbstreinigung mittels Luft und Selbstkonservierung mittels Ethanol. Durch die zusätzliche Automatisierung steigen die Kosten auf 3.000–5.000 USD. Darüber hinaus berücksichtigen diese Designs selten Formfaktoren, die für die Integration in Plattformen oder die Nutzlastbeschränkungen autonomer Fahrzeuge geeignet sind, in einigen Fällen mit freiliegenden Rohren und nicht befestigten Drähten und Elektronik.

(a) 3D-CAD-Rendering des DOT-eDNA-Probenehmers mit teilweise freiliegendem Elektronikbereich. (b) Querschnittsansicht des DOT-eDNA-Probenehmers mit Hervorhebung aller Fächer, Flüssigkeitsaufbewahrungsbeutel und angeschlossenem Fluorometer. (c) Vollständig gebauter DOT-eDNA-Probenehmer, der unter Wasser eingesetzt wird.

Hier stellen wir einen neuartigen, autonomen eDNA-Probenehmer vor, der in der Lage ist, eine Wasserprobe mithilfe eines innovativen Designs zu sammeln, zu filtern und aufzubewahren, alles in einem einzigen Gerät, siehe Abbildung 1. Der Probenehmer kann bis zu 9 einzelne Proben pro Einsatz sammeln, was, Im Gegensatz zu anderen Probenehmern werden sie in einer herausnehmbaren Kassette aufbewahrt, die vor Ort in weniger als 5 Minuten leicht ausgetauscht werden kann. Dies ermöglicht einen sofortigen erneuten Einsatz des Instruments, wobei eine neue Kassette schnell geladen werden kann und die gefüllte Kassette entweder vor Ort oder im Labor analysiert wird. Darüber hinaus ist das Gerät selbstreinigend, um Biofouling zu verhindern, und alle Schläuche sind im Instrumentengehäuse untergebracht, um ein Verhaken der Leitungen während des Einsatzes zu verhindern. Der Probenehmer ist außerdem kompakt und mit zwei Griffen ausgestattet, sodass er von einer einzelnen Person transportiert und eingesetzt werden kann. Der Probenehmer ist über Dartmouth Ocean Technologies Inc., Kanada, im Handel erhältlich. Der anfängliche Marktpreis des eDNA-Probenehmers beträgt 55.000 USD für das Gerät und 5.000–10.000 USD für Reagenzien, Optionen und zusätzliche Filterkassetten. Hier beschreiben wir die ersten Tests des Probenehmers in einem realen Einsatz auf einem kleinen Schiff. Das benutzerorientierte Design des Probenehmers ermöglicht die Standardisierung und Vereinfachung der eDNA-Sammlung und verbessert dadurch die Probenzuverlässigkeit und Wiederholbarkeit für die Umweltüberwachung. Unser Probenehmer war in der Lage, die Ergebnisse, die durch die Verwendung der typischen Niskin-Flaschenerfassungs- und peristaltischen Filtrationsmethoden erzielt wurden, von der Ebene der Mikrobengemeinschaft bis hin zur Ebene der einzelnen Sequenzen abzugleichen.

Die Dalhousie University hat mit Dartmouth Ocean Technologies, Inc. (DOT) zusammengearbeitet, um einen neuartigen eDNA-Probenehmer zu entwickeln, der einen einfachen modularen Ansatz mit drei abnehmbaren Abschnitten aufweist: Filterpatrone, Elektronikabschnitt und Flüssigkeitsspeicherabschnitt, siehe Abb. 1. Der Die vollständig zusammengebaute Einheit hat eine Länge von 72,1 cm und eine Breite von 16,8 cm und wiegt in Luft 11,3 kg und in Salzwasser 3,3 kg. Es ist in der Lage, zwischen Probenaufnahmen zu reinigen, die aufgenommenen Proben aufzubewahren und verfügt über 9 diskrete Filter mit jeweils 25 mm Durchmesser. In die Filterhalter (Advantec 43303010, Polypropylen) können verschiedene Filtermembranen geladen werden, sodass je nach Zielart eine große Vielfalt an Membranmaterialien und Porengrößen verwendet werden kann. Die Filterkartusche des eDNA-Probenehmers besteht aus Polyetheretherketon (PEEK)-Material und enthält die 9 Filterhalter. Sobald die Filterkartusche mit sauberen Filtern beladen ist, kann sie an den Elektronikteil des eDNA-Probenehmers angeschlossen werden. Dieser schnelle Austauschansatz ermöglicht die Vorbereitung mehrerer Filterkartuschen und das anschließende Laden in den Probenehmer nach Bedarf. Die Filterkartusche wird durch drei Knöpfe gesichert, die auf den elektronischen Bereich ausgerichtet sind, um Montagefehler zu vermeiden. Die in diesem Artikel verwendete Version des Probenehmers ist für eine Tiefe von 20 m ausgelegt. Es ist jedoch eine 3000-m-Version verfügbar und wurde erfolgreich in einer Druckkammer in den ESL-Laboren (Dartmouth, NS, Kanada) getestet.

Der Elektronikteil des eDNA-Probengebers ist das Herzstück des Instruments. Es beherbergt eine Pumpe und einen kundenspezifischen Ventilbaum sowie eine kundenspezifische Leiterplatte (PCB) für die Automatisierung und Datenprotokollierung. Die Platine und die Software werden im Abschnitt „Systemarchitektur“ weiter unten beschrieben. Der Ventilbaum besteht aus dem Flüssigkeitsführungsverteiler, einem Drucksensor, Schlauchverbindungen und Magnetventilen für den Probenehmer. Der Ventilbaum verfügt außerdem über Anschlüsse, die zur Fluidkopplung mit den Filtern der Filterkartusche und zum Zugriff auf die mit Reagenzien beladenen und im Flüssigkeitsabschnitt des Probenehmers aufbewahrten Flüssigkeitsbeutel dienen.

Der Flüssigkeitsspeicherbereich des eDNA-Probenehmers beherbergt und schützt alle erforderlichen Flüssigkeiten und ein optionales Fluorometer. Die in diesem Abschnitt gelagerten Flüssigkeiten sind: 5 %ige Salzsäure (HCl) (Reinigung), RNAlater (Konservierung), gereinigtes Milli-Q-Wasser (Spülung) und Abfall. Die Flüssigkeiten werden in 100 und 500 ml Labtainer\(^{\textrm{TM}}\) BioProcess Containers (BPC) gelagert und mit 1/4–28 Anschlüssen an den Elektronikbereich angeschlossen. Der Abfallbeutel dient zur Aufbewahrung von Chemikalien, die nicht sicher ins Meer oder in die umliegenden Gewässer gelangen dürfen. RNAlater wird zum Konservieren der gesammelten Proben verwendet, 5 % HCl wird zum Reinigen der Systemflüssigkeitsleitungen und zum Rückfluss in den Probeneinlass verwendet, und Milli-Q wird zum Spülen des Systems zwischen den Protokollschritten verwendet. Die 5 %ige HCl und Milli-Q reduzieren wirksam Kreuzkontaminationen, die zwischen Probenahmevorgängen in den Systemschläuchen und -verteilern auftreten können. HCl und RNAlater, die in dieser Studie verwendet wurden, waren von analytischer Qualität und wurden von Fisher Chemical (Waltham, MA, USA) geliefert.

Das Flüssigkeitsschema des eDNA-Probenehmers ist in Abb. 2 dargestellt. Der eDNA-Probenehmer verfügt über mehrere Magnetventile, Filtermembranen, integrierte Chemikalien und Zugang zu den umgebenden Flüssigkeiten über die Probeneinlass- und -auslassanschlüsse. Der eDNA-Probenehmer verfügt über benutzerdefinierte Steuerskripte, die zur Koordinierung der Vorgänge zwischen den Magnetventilen und der Spritzenpumpe verwendet werden. Durch diese Koordination kann Flüssigkeit von einer Stelle des Probenehmers zu einer anderen bewegt werden. Die Flüssigkeitsbewegung erfolgt gleichzeitig mit der Überwachung und Protokollierung der Fluorometer- und Druckwerte. Die benutzerdefinierten Skripte können im Flash-Speicher oder auf der SD-Karte des eDNA-Probenehmers programmiert oder zur besseren Kontrolle manuell über ein Terminal eingegeben werden. Das für dieses Papier verwendete Skript wurde manuell über das Terminal eingegeben, um dem Benutzer eine bessere Kontrolle und Debug-Sichtbarkeit zu geben, da der Sampler hier zum ersten Mal eingesetzt wurde. Das benutzerdefinierte Skript enthält das Probenahmeprotokoll, das Folgendes festlegt: Anzahl der aktiven Ventile, Sammelvolumen, Zeitlimit und Mindestflussrate für jeden seiner Schritte.

Flüssigkeitsschema für den DOT eDNA-Probenehmer. Neun Filter werden für die planmäßige Probenentnahme verwendet, indem je nach Partikelbeladung der Probe 15 ml bis 10 l oder mehr Wasser gefiltert werden. Ein Inline-Drucksensor dient zur Überwachung des Transmembrandrucks, um Materialansammlungen auf der Filtermembran zu erkennen. RNAlater, 5 % HCL und Milli-Q-Wasser verfügen über Leitungswege, die der Konservierung und Reinigung dienen.

(a) Protokoll zum Auffangen und Konservieren von Proben und anschließenden Reinigen von Flüssigkeitskanälen. (b) Flussdiagramm mit Schwellenwerten, das zum Laden und Ausführen von Protokollen innerhalb eines sicheren, vom Benutzer angegebenen Betriebsbereichs verwendet wird (F – Durchflussrate, P – Druck, T – Zeit, V – Volumen). (c) Druckdaten, die während des Probenahmevorgangs auf einer 0,22 \(\upmu\)m Polycarbonat-Filtermembran erfasst wurden. * Die Probenahmezeit hängt von der protokollspezifischen Durchflussrate und der Trübung der Flüssigkeit ab. Die oben angegebene Zeit gilt für 20 ml/min unter idealen Bedingungen.

Das für die in diesem Dokument beschriebene Bereitstellung verwendete Probenahmeprotokoll ist in Abb. 3a dargestellt. Unter jedem Schritt wird die voraussichtliche Fertigstellungszeit angezeigt. Der Schritt „Sample Prime“ beginnt mit dem Probenahmeprotokoll und bereitet den Probenehmer vor, indem seine internen Kanäle mit der vorgesehenen Probenflüssigkeit gespült werden. Danach ist der Probenehmer bereit, den Schritt „Probenerfassung“ durchzuführen. Bei diesem Schritt wird die Probenflüssigkeit zur Probenerfassung durch die ausgewählte Filtermembran (M1 bis M9) gedrückt. Um das auf dem Filter gesammelte Material zu konservieren, drückt der Schritt „RNAlater Preservation“ das RNAlater durch die ausgewählte Filtermembran. Der „MQ Flush“-Schritt verwendet dann Milli-Q, um RNAlater aus dem System zu spülen, um zu verhindern, dass es mit 5 %iger HCl in Kontakt kommt, die im nächsten Schritt verwendet wird. Der Schritt „Säurereinigung“ reinigt die internen Fluidkanäle des Probenehmers von Verunreinigungen mithilfe von 5 %iger HCl. Als nächstes spült der „MQ Flush“-Schritt die 5 %ige HCl mit Milli-Q aus den Kanälen. Dieser Prozess reinigt den Probenehmer und bereitet ihn für die nächste Probennahme vor. Es besteht die Möglichkeit, dass Restsäure in der Nähe des Probeneinlasses zurückbleibt, nachdem der Probeneinlass mit Säure zurückgespült wurde. Allerdings drückt das Standardprotokoll nach der Säurerückspülung auch 9 ml Milli-Q durch den Probeneinlass, um die Leitungen und den Säureeinlass zu spülen. Dadurch wird die verdünnte 5 %ige HCl weiter vom Probeneinlass entfernt und eine konvektive Strömung ermöglicht, lokalisierte Säure vor der nächsten Probenahme zu entfernen. Bei diesem Einsatz erfolgte die Säurespülung am Ende einer Probenahme und es wurden mindestens 30 Minuten zwischen aufeinanderfolgenden Proben eingehalten. Zukünftig könnte dem Protokoll eine Mindestwartezeit für Gewässer mit geringem Durchfluss oder stehendem Wasser hinzugefügt werden, um ein falsch negatives Ergebnis zu verhindern, bei dem HCL die Probe vor der Entnahme in der Umgebung verdauen würde.

Der in Abb. 3b gezeigte Algorithmus wird immer dann ausgeführt, wenn die Probenerfassung ausgelöst wird. Dieser Algorithmus führt die im Probenahmeprotokoll gezeigten Schritte aus und überwacht Volumen, Druck und Zeit, um sicherzustellen, dass der Probenehmer innerhalb eines tolerierbaren Betriebszustands bleibt. Der Algorithmus führt zunächst eine Reihe von Prüfungen durch. Die erste Prüfung besteht darin, festzustellen, ob der Druck im System einen voreingestellten Druckgrenzwert nicht überschreitet. Wenn der Druck diesen Grenzwert überschreitet, reduziert das System die Durchflussrate um voreingestellte 40 %. Anschließend überprüft das System die Durchflussrate, die verstrichene Zeit und das Volumen seit Beginn des Protokollschritts. Wenn einer der Grenzwerte überschritten wird, fährt der Sampler mit dem nächsten Schritt im Skript fort. Dieser Vorgang wird dann wiederholt, bis im Probenahmeprotokoll keine Schritte mehr vorhanden sind. Der Sampler wechselt dann in einen Energiesparzustand und wartet auf einen Interrupt, um das Sampling-Protokoll erneut auszulösen. Abbildung 3c zeigt das Druckprofil eines kürzlichen Einsatzes eines eDNA-Probenehmers, bei dem das in Abb. 3a gezeigte Probenahmeprotokoll durchgeführt wurde.

Der Probenehmer ist autonom, da er alle Funktionen ausführen kann, nachdem er mit einem Probenplan programmiert wurde, ohne dass eine menschliche oder Benutzerinteraktion erforderlich ist. Zu den Funktionalitäten gehören Probenerfassung, Selbstreinigung und Probenkonservierung. Die einzige menschliche Interaktion besteht darin, neben der Programmierung des Zeitplaners auch die Filterkartusche, die Chemikalien und die Batterie zu wechseln. Über die geplante Auslösung hinaus verfügt der eDNA-Probenehmer über einen integrierten 32-Bit-Prozessor, der eine Auslösung durch externe Sensoren und Computer (z. B. AUV-Rücksitzsysteme) ermöglicht.

Die Systemarchitektur des eDNA-Probennehmers ist in Abb. 4a dargestellt. Abbildung 4b zeigt eine vollständig aufgebaute Leiterplatte für den eDNA-Probennehmer. Aufgrund der unterschiedlichen elektrischen Anforderungen der Unterkomponenten verfügt das System über Regler zur Erzeugung mehrerer Spannungen im Bereich von 3,3 bis 12 VDC, die alle von einer Batterie oder einem Netzteileingang von 7–24 VDC gespeist werden. Der große Spannungseingangsbereich ermöglicht Flexibilität bei den für den Einsatz verwendeten Plattformen (UAV/USVs, Bojen, Liegeplätze usw.). Das System wird über einen ARM Cortex M4-Mikrocontroller (STM32F411) gesteuert, der mit 84 MHz läuft und als Echtzeitsystem (RTS) konfiguriert ist, das durch mehrere Interrupts und Low-Level-Steuerungen gesteuert wird, um ein präzises Timing zu gewährleisten. Der einzelne Mikrocontroller verwaltet die Spritzenpumpe, die Datenprotokollierung, die Kommunikation und die Protokollausführung. Die Spritzenpumpe (eine säuretolerante kundenspezifische Variante der LPDA1750330H, Lee Company Ltd.) wird von einer Schrittmotor-Treiberschaltung (DRV8834, Texas Instruments) zusammen mit einem optischen Quadratur-Encoder angetrieben, um die präzise Verfolgung des verwendeten Volumens zu unterstützen. Die 26 vom System verwendeten Magnetventile werden von einer Spike-and-Hold-Schaltung (DRV8860, Texas Instruments) angesteuert, die die Versorgung von 32 Ventilen ohne übermäßige Strombelastung ermöglicht. Der DRV8860 ist ein seriell anschließbares Gerät und ermöglicht einen modularen Aufbau zur Erweiterung der Magnetspulen, die vom System verwendet werden können. Der eDNA-Sampler nutzt ein 16-Bit-ADC-Modul (ADS1115, Texas Instruments), das mit seinem integrierten programmierbaren Verstärkungsverstärker (PGA) den Drucksensor in einer Wheatstone-Brückenkonfiguration auslesen kann. Das verstärkte Signal ermöglicht das Ablesen von Differenzdruckmessungen zwischen den Membranen, um sicherzustellen, dass die Membranen innerhalb der Herstellerspezifikationen verwendet werden (typischerweise unter 4 bar, 60 psi). Ein optionaler Drucksensor kann hinzugefügt werden, um den Umgebungsdruck der Umgebung und die Tiefe des Probenehmers abzulesen. Der Sampler speichert alle Daten auf einer internen 32 GB großen microSD-Karte mit zeitgestempelten Dateien und Ordnern. Benutzer kommunizieren mit dem eDNA-Probenehmer entweder über Bluetooth (über eine Smartphone-Anwendung) und/oder über RS-232 und ein PC-Terminal. Beide ermöglichen die Übermittlung von Betriebsbefehlen an den Probenehmer und dienen auch als Kanäle für die Datenübertragung zum/vom System. zum Beispiel das Festlegen geplanter Probenahmezeiten über die Echtzeituhr (RTC) und/oder das Abrufen von Druck- und Fluorometerdaten pro Membran/Probe. Im Leerlauf verbraucht das System 1 W, beim Sampling sind es 10 W Spitzenleistung.

(a) Architekturdiagramm für den DOT eDNA-Sampler, das interne elektrische Verbindungen und Komponenten sowie Schnittstellen zur Außenwelt zeigt, basierend auf dem STM32F411-Mikroprozessor. (b) Vorderansicht der entworfenen Leiterplatte mit oberflächenmontierten Komponenten.

Der eDNA-Probenehmer wurde für den in dieser Arbeit beschriebenen Einsatz mit einer Batterie betrieben. Der einzelne Akku, 561,6 Wh Lithium-Thionylchlorid, hielt den gesamten Einsatzzeitraum durch. Vorausgesetzt, dass die Membranen nicht verstopft sind, kann die Batterie maximal 33,7 l pumpen, was für 32 Filteraufnahmen bei 1 l pro Aufnahme und einer durchschnittlichen Durchflussrate von 10 ml/min ausreichen sollte. Die gepumpten Liter sind die am besten geeignete Kennzahl für die Angabe der erwarteten Batterielebensdauer, da die Pumpe im eDNA-Probenehmer den meisten Strom verbraucht (8 W, 80 % des Leistungsbudgets in der Spitze). Diese Annahmen hängen auch von der Trübung/Partikelbelastung des Wassers bei der Probenahme ab. Über den Batterie- oder Stromverbrauch hinaus sind Flüssigkeiten derzeit der begrenzende Faktor für den kontinuierlichen Einsatz, da die Standardreagenzienreservoirs für 1 Filterkartusche (9 Filteraufnahmen) reichen. Es ist geplant, eine Version mit erhöhter Flüssigkeitskapazität anzubieten, die 3 Filterkartuschen (27 Filter) unterstützen würde Aufnahmen).

Während wir für diese Demonstration keine externe Stromquelle benötigten, kann der eDNA-Probenehmer auch mit einer typischen 7- bis 24-V-Gleichstromversorgung betrieben werden. Die Stromversorgung erfolgt über ein 6-poliges Subconn-Kabel und kann über ein Fahrzeug oder eine Plattform erfolgen. Aufgrund des geringen Stromverbrauchs des eDNA-Probennehmers (10 W Spitze) eignet sich der Probennehmer hervorragend für die Hotellast, die bei den meisten autonomen Fahrzeugen und auch bei solarbetriebenen Bojen oder Anlagen vorhanden ist.

Als erster Test der Leistung dieses eDNA-Probenehmers vor Ort wurde der Probenehmer während eines Transekts vom Hafen von Halifax in das Bedford-Becken eingesetzt, wie in Abb. 5 dargestellt. Die Probenentnahme wurde entlang einer Reihe von Stationen für diesen Transekt im Bedford-Becken durchgeführt , wobei jede Station einmal abgetastet wurde. An jeder Station wurde die Einheit 5 m tief eingesetzt und der erste Teil des Skripts wurde ausgeführt, bei dem eine einzelne Probe von 125 ml Wasser durch ein 0,22 \(\upmu\)m Polycarbonat (PC) mit 25 mm Durchmesser gefiltert wurde. Membran (Millipore). Der Probenehmer war während der gesamten Zeit, in der das Boot an Ort und Stelle war (15–17 Minuten), im Einsatz, um sicherzustellen, dass die gesamten 125 ml aufgefangen wurden. Nachdem der Probenehmer wieder an Deck gezogen wurde, wurde der zweite Teil des Skripts ausgeführt, bei dem 6 ml RNAlater zur Konservierung über die Membran gepumpt wurden und der Schritt „Säurereinigung“ durchgeführt wurde. Aufgrund der Zeitbeschränkungen für die Instandhaltung der Station wurde dieser zweistufige Ansatz umgesetzt; Beide Schritte lassen sich jedoch problemlos kombinieren, wenn der Probenehmer bestimmungsgemäß und ohne menschliches Eingreifen eingesetzt wird. Die Proben wurden in RNAlater über Nacht in der Kassette gelagert, danach wurden sie und der 35 μm Vorfilter entfernt und kurzzeitig in einem Gefrierschrank bei –20 °C gelagert längerfristig in einem Gefrierschrank bei −80 \(^{\circ }\)C vor der Extraktion der DNA. Obwohl der Probenehmer die Proben automatisch mit RNAlater konserviert, wurden die Filter aufgrund des unbekannten Zeitrahmens zwischen Transekt und DNA-Extraktion wie für die Langzeitlagerung empfohlen eingefroren. Für diesen Einsatz verfügte der Probenehmer über einen 35 µm großen Vorfilter am Einlass. Dieser Einlassfilter wurde hinzugefügt, da die Ventile im aktuellen Aufbau nicht für Partikel über 35 \(\upmu\)m ausgelegt sind. Der Vorfilter kann den Probenehmer auf Anwendungen zur Untersuchung von Mikroorganismen mit Zellgrößen von weniger als 35 \(\upmu\)m beschränken. Wir untersuchen derzeit die Systemleistung mit einem größeren 100 \(\upmu\)m Vorfilter.

Karte der Probenahmestellen im Hafen von Halifax. Die Stationen werden in fortlaufender Reihenfolge nummeriert, wobei S1 an erster Stelle und S6 an letzter Stelle steht. Die Proben bei S3 und S4 wurden am selben Ort im Abstand von etwa 2 Stunden entnommen. Gestapelte Balkendiagramme heben die zehn relativ häufig vorkommenden taxonomischen Bakterienfamilien an jeder Probenahmestation für alle Proben hervor. Alle ASVs, die nicht zu den Top-10-Familien gehören, werden als „Andere“ dargestellt. Die hier vorgestellte Karte wurde in RStudio36 mit GADM-Daten (Version 3.6)48 und den R-Paketen ggplot239 und ggsn49 erstellt.

Karte der Probenahmestellen im Hafen von Halifax. Die Stationen werden in fortlaufender Reihenfolge nummeriert, wobei S1 an erster Stelle und S6 an letzter Stelle steht. Die Proben bei S3 und S4 wurden am selben Ort im Abstand von etwa 2 Stunden entnommen. Gestapelte Balkendiagramme wurden erstellt, indem die zehn relativ häufigsten Chloroplasten-16S-rRNA-ASVs in jeder Probe identifiziert wurden. ASVs werden bis zum niedrigstmöglichen taxonomischen Rang identifiziert, und ASVs mit derselben Taxonomie werden weiter in „ASV 1“ bis „ASV 3“ unterschieden. Das erste ASV in der Legende, gekennzeichnet als „Cyanobacteria ASV 1“, ist das einzige ASV, das auch aus dem Vorfilter gewonnen wurde. Die hier vorgestellte Karte wurde in RStudio36 mit GADM-Daten (Version 3.6)48 und den R-Paketen ggplot239 und ggsn49 erstellt.

An jeder Station wurden zur gleichen Zeit und in derselben Tiefe parallele Flaschenproben entnommen, wobei eine an einem Seil befestigte 5-Liter-Niskin-Flasche verwendet wurde. An jeder Station wurde der Niskin eingesetzt, um eine Wasserprobe direkt neben dem Probenehmer zu entnehmen. Diese Wasserprobe wurde dann in zwei Flaschen aufgeteilt, die beide an Deck mit einer peristaltischen Pumpe durch PC-Membranen (Millipore) mit 47 mm Durchmesser und 0,22 µm gefiltert wurden, was zu doppelten Filtern bei jedem Niskin-Einsatz führte. Für jedes Duplikat wurden zwischen 660 und 1140 ml Wasser filtriert, anschließend wurde das filtrierte Volumen aufgezeichnet und die Membranen sofort in einem mit flüssigem Stickstoff vorgefüllten Kryotransporter eingefroren.

DNA von allen Probenahmefiltern und ein Niskin-Duplikat von jeder Station wurden extrahiert und verarbeitet. Die anderen Niskin-Proben wurden archiviert und bei −80 \(^{\circ }\)C als Backup aufbewahrt, für den Fall, dass es Probleme bei der Extraktion oder Sequenzierung gab. Das Qiagen DNeasy Plant Mini Kit wurde verwendet, um DNA aus allen Proben zu extrahieren, wobei ein modifiziertes Protokoll basierend auf Zorz et al.25 mit den folgenden zusätzlichen Modifikationen verwendet wurde: Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 52 \(^{\circ }\)C inkubiert Dieselben 50 μl Elutionspuffer von Qiagen (AE-Puffer) wurden verwendet, um die DNA zweimal zu eluieren, um sicherzustellen, dass maximale DNA-Konzentrationen extrahiert wurden. Nach der Extraktion wurden 10 µl DNA aus jeder Probe zur Illumina-Sequenzierung an das Integrated Microbiome Resource Lab (IMR) der Dalhousie University geschickt. Die DNA wurde für die V4-V5-Region des ribosomalen 16S-RNA-Gens gemäß dem IMR-Standardverfahren für die Amplikonsequenzierung sequenziert, wie in Comeau et al.26 beschrieben. 16S-Amplikonfragmente wurden in zweifacher Ausfertigung unter Verwendung einer einzelnen PCR-Runde unter Verwendung von Fusionsprimern (Illumina-Adapter + Indizes + spezifische Regionen) 515F = 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′ und 926R = 5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′27,28 amplifiziert.

Die Sequenzen wurden gemäß dem von IMR26 entwickelten Microbiome Helper unter Verwendung von QIIME2 2019.729 verarbeitet. Deblur (QIIME2-Plugin-Version 2019.7)30 wurde verwendet, um Sequenzen zu entrauschen sowie einzelne Amplikonsequenzvarianten (ASVs) zu identifizieren und zu kennzeichnen31. ASVs sind Cluster stark verwandter DNA-Sequenzen, die als eine einzige homogene Einheit behandelt werden; Jedes ist einer bestimmten taxonomischen Gruppe, beispielsweise einer Art, zugeordnet, wobei möglicherweise mehrere ASVs derselben Gruppe zugeordnet sind. Nach der Identifizierung wurden ASVs mithilfe der SILVA 132-Datenbank32,33 sowie der PhytoREF-Datenbank34 zur weiteren Klassifizierung von Chloroplastensequenzen klassifiziert. Aus diesen Daten wurden zwei ASV-Tabellen erstellt: eine mit den rohen ASV-Zahlen und eine zweite, in der die rohen ASV-Zahlen auf 4000 reduziert wurden, damit die relative Häufigkeit zwischen den Proben verglichen werden konnte. Rarefaction ist ein Normalisierungsprozess, bei dem Stichproben unterschiedlicher Größe auf einen normalisierten Schwellenwert unterabgetastet werden35. Die Verdünnungskurven in Abb. S2 finden Sie in den Hintergrundinformationen. Alle Diagramme wurden mit RStudio36 und den folgenden Paketen erstellt: UpSetR37, Phyloseq38, ggplot239 und ggpmisc40.

Insgesamt wurden beim ersten Feldeinsatz des eDNA-Probenehmers 6 Stationen beprobt; Die Koordinaten und der Zeitpunkt der Probenentnahme finden Sie in Tabelle S1. Die Karte der abgetasteten Stationen ist in Abb. 5 dargestellt. Bei 2 der 6 Stationen, S2 und S6, wurde die voreingestellte Ziellautstärke nicht erreicht. Dies war darauf zurückzuführen, dass der Transmembrandruck den Schwellenwert erreichte und sich genügend Material ansammelte, um die Filtermembran zu blockieren. Daher wurde der Zeitschwellenwert für den Aufenthalt in der Station vor dem Volumenschwellenwert erreicht. An den verbleibenden Stationen S1, S3, S4 und S5 wurden 100 % der Probe erfasst, wie in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 zeigt verschiedene Metriken bezüglich der extrahierten DNA und rohen Sequenzierungsdaten für jede Transektprobe und den Vorfilter. Obwohl die eluierte DNA-Konzentration in den mit dem Probenehmer gesammelten Proben niedriger war, ist die ursprüngliche DNA-Quellenkonzentration (z. B. Meerwasser) unter Berücksichtigung des Unterschieds im gefilterten Volumen zwischen dem Niskin und dem Probenehmer vergleichbar, jedoch nicht identisch, da DNA-Extraktionen nicht zu 100 % effizient sind . Außerdem wies der Vorfilter eine geringere eluierte DNA-Konzentration auf und betrug in der Originalprobe nahezu 0 ng/ml.

Abbildung 5 zeigt die 10 Familien mit der höchsten relativen Häufigkeit an jeder Station für beide Sammelmethoden, die auch in Abb. S1 nebeneinander dargestellt sind. Die beiden Sammelmethoden lieferten die gleichen Top-Familien in nahezu identischer relativer Häufigkeit, was zeigt, dass der Probenehmer in der Lage war, die gleiche Gemeinschaftszusammensetzung häufiger Mikroben zu erfassen wie der Niskin. Alle 10 am häufigsten vorkommenden Familien wurden in allen 12 Proben gefunden, wobei Rhodobacteraceae an 5 von 6 Stationen (9 % in S1, 5 % in S3–S6) und Flavobacteraceae den größten Unterschied in der relativen Häufigkeit zwischen Niskin und Probenehmer aufwiesen Der größte Unterschied liegt in S2 (6 %). Der Unterschied zwischen allen anderen Taxa an jeder Station betrug mit Ausnahme von Burkholderiaceae weniger als 5 %. Die Familie Burkholderiaceae zeigte eine hohe Varianz an Standort S1 (Probenehmer: 10 %, Niskin: 2 %) und in geringerem Maße S2 (Probenehmer: 4 %, Niskin: 2 %). Dies war auf ein bestimmtes ASV zurückzuführen, das als Ralstonia picketti klassifiziert wurde und in allen Probenahmeproben, jedoch in keiner der Niskin-Proben gefunden wurde. Eine ähnliche Analyse der Phytoplanktongemeinschaft in Abb. 6 zeigt eine starke Blüte von Thalassiosirales, die sich als einzelnes Chloroplasten-ASV präsentierte, das beide Probentypen (Niskin und Probenehmer) an allen Stationen dominierte und von 30 % aller Chloroplasten-Messungen in S4 Niskin bis 60 reichte % in S3 Niskin. In der Vorfilterprobe wurden keine Hinweise auf Thalassiosirales gefunden, und das einzige im Vorfilter gefundene ASV (dargestellt als Cyanobakterien in Abb. 6) wurde in den übrigen Proben in geringer relativer Häufigkeit gefunden.

Streudiagramme, die die Rohzahlen aller ASVs in Proben aus jeder Sammelmethode im Vergleich zueinander zeigen. Der einzelne rote Punkt zeigt die Rohwerte von Ralstonia picketti an, einem potenziellen Schadstoff, der nur im Probenehmer vorkommt. Die Verunreinigung nimmt mit zunehmender Nutzung des Probenehmers von S1 bis S6 ab, was darauf hindeutet, dass neue Probenehmer nach dem Zusammenbau gründlich gereinigt werden müssen, um Verunreinigungen zu entfernen.

Die Ergebnisse der Niskin- und eDNA-Probenahme waren auch auf der Ebene der einzelnen ASVs quantitativ ähnlich. Abbildung 7 zeigt die Korrelation zwischen Sampler-ASVs und Niskin-ASVs (sowohl Bakterien als auch Phytoplankton) an jedem Standort. Die R\(^{2}\)-Werte lagen im Bereich von 0,71 bis 0,93, wobei spätere Stationen höhere R\(^{2}\)-Werte aufwiesen als die Stationen S1 und S2. Der zuvor erwähnte Ralstonia picketti ASV ist rot hervorgehoben und weist höhere Vorkommen in S1 und S2 auf (7,5 % bzw. 2 % der Gesamtvorkommen), während die Häufigkeit in den Stationen S3–S6 geringer ist (\(\le\) 1 % der Gesamtvorkommen). zählt). Abbildung S3 zeigt ein Streudiagramm der kombinierten Zählungen jedes ASV über die Stationen 1–6 für jede Methode.

Upset-Diagramm der ASVs in jeder Probe sowie im Vorfilter (PF). Jede Spalte zeigt die Anzahl der ASVs mit dem durch die schwarzen Punkte angezeigten Vorkommensmuster mit den zugehörigen Proben. Die Gesamtzahl der mit jeder Probe verknüpften ASVs wird links angezeigt. Hier werden Probensätze mit 3 oder mehr assoziierten ASVs angezeigt, wobei Probenkombinationen, die nur ein- oder zweimal auftretende ASVs zurückgeben, nicht angezeigt werden.

Abschließend untersuchten wir die Muster der Anwesenheit und Abwesenheit jedes ASV in den 13 Sampler-, Niskin- und Vorfilterproben. Das häufigste Anwesenheits-/Abwesenheitsmuster umfasste 190 ASVs, die nur in der Vorfilterprobe gefunden wurden (Abb. 8); Diese machen jedoch weniger als 10 % aus (20.936 von 235.501 aus allen Proben gesammelten Sequenzen). Im Vorfilter und mindestens einer weiteren Probe wurden dagegen nur 65 ASVs gefunden. Dies unterstreicht weiter, dass der Vorfilter keine wichtigen ASVs in der Wassersäule herausfilterte, sondern stattdessen eine eigene Zusammensetzung aufwies. An allen zwölf Probenstandorten im Bedford Basin wurden insgesamt 124 ASVs gefunden, von denen 24 auch aus dem Vorfilter gewonnen wurden. Davon entfielen auf die 100 ASVs, die nur an Standorten im Bedford Basin gewonnen wurden, 171.345 Sequenzen (72,8 %), während die 24 aus allen Proben gewonnenen ASVs 23.341 Sequenzen (10,0 % aller wiederhergestellten Sequenzen) ausmachten. Bei mehr als sieben ASVs wurde kein anderes Anwesenheits-/Abwesenheitsmuster festgestellt, und die meisten Muster wurden im ASV-Pool ein- oder zweimal beobachtet. Diese Ergebnisse belegen außerdem die Homogenität der Proben über die Stationen hinweg und die Konsistenz zwischen den Datensätzen des Probenehmers und Niskin. In allen eDNA-Probenproben wurden insgesamt 4308 Sequenzen dem wahrscheinlichen Kontaminanten Ralstonia pickettii zugeordnet; Ihre Zahl verringerte sich von 4308 in Probe S1 auf 80 in der letzten Probe S6.

Die in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse beschreiben detailliert die erfolgreiche Erprobung und den Einsatz eines neuartigen eDNA-Probenehmers. Im Vergleich zu den gleichzeitigen Niskin-Flaschenproben erfasste der Probenehmer an allen Stationen eine nahezu identische Gemeinschaft sowohl für Bakterien als auch für Phytoplankton. Dies trotz Unterschieden im Protokoll wie Volumenfilterung und zeitlicher Auflösung, die mit früheren Studien übereinstimmen, die ähnliche Ergebnisse gezeigt haben42,43. Eine kürzlich mit dem 3G ESP durchgeführte Studie zeigte auch, dass die Ergebnisse zwischen autonomer und manueller Probenahme gleichwertig waren44. Interessanterweise waren die Probenvolumina in der ESP-Studie umgekehrt, wobei der autonome Probenehmer ein höheres Volumen (1 l) und die manuelle Probenahme ein niedrigeres Volumen (36–100 ml) filtrierte44. Unser Protokoll lieferte vergleichbare Ergebnisse mit einem geringeren autonomen Probenahmevolumen, wodurch die Probenahmezeit auf ein Minimum beschränkt werden konnte.

Ein weiterer Unterschied zwischen der Probenehmer- und der Niskin-Methode ist der 35 μm-Vorfilter, der aufgrund der Partikelbeschränkungen an der Pumpe und den Ventilen am Einlass des Probenehmers angebracht ist. Die Ergebnisse hier zeigen jedoch, dass der Vorfilter die Ergebnisse nicht beeinflusste, da der Probenehmer weiterhin die Gemeinschaft in der Wassersäule aufnahm. Die Beibehaltung des Vorfilters ist von Vorteil, da der Probenehmer dadurch eine kleine, tragbare Größe behält und so einen einfacheren Einsatz vor Ort ermöglicht, insbesondere auf kleinen Schiffen mit wenig Platz an Deck. Der Vorfilter beeinträchtigte die Ergebnisse auch nicht durch Verstopfungen, da das Reinigungsprotokoll und die Vorprobenspülungen eine Rückspülung durch den Einlass beinhalten, wodurch Material aus dem Vorfilter gedrückt wird.

Die einzige auffällige Diskrepanz zwischen den Proben bestand darin, dass in allen Probenahmeergebnissen, jedoch in keinem der Niskin-Ergebnisse, ein als Ralstonia picketti klassifiziertes ASV gefunden wurde. Dieses Bakterium kommt häufig in der Umwelt vor und kann auf Kunststoffen wachsen45, was bedeutet, dass es sich wahrscheinlich um eine Form der Kontamination des Probenehmers aus früheren Tests handelte. Trotz der Prävalenz dieses Bakteriums nahmen die Rohzahlen und die relative Häufigkeit bei den nachfolgenden Probenahmen schnell ab, was darauf hindeutet, dass das Reinigungsprotokoll das Bakterium mit jeder Probe aus den Leitungen entfernte. Daher kann das Reinigungsprotokoll durch eine Optimierung künftig einer Kontamination vorbeugen.

In dieser Arbeit wurden keine Negativkontrollen verwendet. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Niskin-Flaschenerfassungen als Kontroll- oder Vergleichsmechanismus fungieren. Das System kann jedoch so konfiguriert werden, dass die integrierten Milli-Q-Reserven als negativer Kontrollmechanismus genutzt werden. Unter der Annahme, dass das Reagenzienvolumen keine Einschränkung darstellt, könnte eine Betriebsart darin bestehen, zwischen jeder Probe einen Milli-Q-Leerwert oder 5 Proben und 4 Blindwerte anzulegen. Der Nachteil dabei sind die potenziell großen Mengen an Milli-Q (Blind-/Negativkontrolle), die nach jedem Einsatz eingesetzt und ersetzt werden müssten.

In dieser Studie wurde jeder Standort einmal mit dem eDNA-Probenehmer und der Niskin-Flaschenerfassung beprobt. Frühere Veröffentlichungen zeigen jedoch, dass sich die Bakterienzusammensetzung im Bedford Basin46 wöchentlich ändern kann. Nachdem nun gezeigt wurde, dass die anfängliche eDNA-Probenehmerkonfiguration erfolgreich eingesetzt werden kann, würden Zeitreihenstudien in verschiedenen aquatischen Umgebungen Einblicke in mikrobielle Veränderungen mit minimaler menschlicher Beteiligung ermöglichen. Über Zeitreihenstudien hinaus kann auch der Einsatz mehrerer Probenehmer in Replikaten durchgeführt werden, um die Wiederholbarkeit zwischen Instrumenten zu bewerten. Beide Arten von Studien sind derzeit für 2023–2024 geplant und sehen den Einsatz von sechs Probenehmern über mehrere Monate hinweg vor.

Zukünftige Studien könnten auch zur Untersuchung von eRNA genutzt werden, um den Vorteil zu nutzen, dass der Sampler Nukleinsäuren unmittelbar nach der Probenahme konserviert. Obwohl wir mit RNAlater eine hervorragende Leistung beobachtet haben, wäre es von Vorteil, verschiedene Chemikalien zur Konservierung zu testen, da es viele Labore gibt, die andere Lösungen wie Longmires Puffer47 und DNAgard\(\circledR\)16 zur Konservierung ihrer Proben verwenden.

Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse die erfolgreiche Erprobung und den erfolgreichen Einsatz eines neuartigen, autonomen eDNA-Probenehmers, der sowohl reinigen als auch konservieren kann und über eine vor Ort austauschbare Kartusche verfügt. Diese Aspekte sind für Forschung und Überwachung von Vorteil, insbesondere an abgelegenen Orten und über lange Zeiträume in Gebieten wie Meeresschutzgebieten (MPAs). Zukünftige Studien des Systems werden die Optimierung der Reinigung sowie die Integration von Fluorometern und gemeinsame Tests des Systems in mehreren Einsatzszenarien umfassen. Insgesamt wird dieser eDNA-Probenehmer die Verwendung von eDNA in Überwachungsprogrammen erweitern und ihn zugänglicher und bequemer machen als herkömmliche Probenahmemethoden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im National Center for Biotechnology Information Repository verfügbar, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA917080.

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem Canada's Ocean Supercluster (OceanAware Project), dem National Research Council of Canada's Industrial Research Assistance Program (NRC IRAP), dem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada Discovery Grant Program, dem Mitacs Industrial Postdoc Fellowship Program, der Canada First Research Excellence Fund (CFREF) über das Ocean Frontier Institute (OFI) und die Canada Foundation for Innovation (CFI). Wir danken Dr. Jennifer Tolman für ihre Unterstützung bei der DNA-Analyse und Prof. Ruth Musgrave für die Erlaubnis, an ihrem Hafentransekt teilzunehmen. Wir danken Lee Miller und Mark Wright für ihre Beiträge zur Gestaltung des Gehäuses des eDNA-Samplers und zur Darstellung seiner Bilder zur Verwendung in diesem Artikel.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Andre Hendricks und Connor M. Mackie

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, Dalhousie University, Halifax, NS, Kanada

Andre Hendricks, Colin Sonnichsen & Vincent Sieben

Dartmouth Ocean Technologies Inc, Dartmouth, NS, Kanada

Connor M. Mackie, Edward Luy, Colin Sonnichsen, James Smith, Iain Grundke, Arnold Furlong, Robert G. Beiko, Julie LaRoche und Vincent Sieben

Abteilung für Pharmakologie, Dalhousie University, Halifax, NS, Kanada

Mahtab Tavasoli

Fakultät für Informatik, Dalhousie University, Halifax, NS, Kanada

Robert G. Beiko

Abteilung für Biologie, Dalhousie University, Halifax, NS, Kanada

Julie LaRoche

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Alle Autoren trugen zu Aspekten des Entwurfs, der Herstellung und des Tests des Instruments bei. AH, EL und CS erstellten den ursprünglichen Entwurf, AH und CM führten den Großteil der experimentellen Arbeit durch, CM führte mit Unterstützung von JS Feldforschungen durch und IGIG war für den Maschinenbau verantwortlich; AH und JS haben die Elektrotechnik übernommen. RB, CM und JLR führten eine Genomdatenanalyse durch. MT, RB, AF, JLR und VS akquirierten Fördermittel und betreuten das Projekt. Alle Autoren haben das Manuskript geschrieben, überprüft und bearbeitet.

Correspondence to Vincent Sieben.

Arnold Furlong, Julie LaRoche, Mahtab Tavasoli, Robert Beiko und Vincent Sieben geben Anteilsbeteiligungen an DOT Inc. an. Connor Mackie, Edward Luy, Colin Sonnichsen, James Smith und Iain Grundke sind bei DOT Inc. beschäftigt. Andre Hendricks hat kein finanzielles Interesse an DOT Inc.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hendricks, A., Mackie, CM, Luy, E. et al. Kompakter und automatisierter eDNA-Probenehmer für die In-situ-Überwachung von Meeresumgebungen. Sci Rep 13, 5210 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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Eingegangen: 19. Dezember 2022

Angenommen: 25. März 2023

Veröffentlicht: 30. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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